Protéine de transfert de lipides

La description des premières protéines de transfert de lipides (LTP) a été faite en 1975 par l'équipe de Jean-Claude Kader[7] qui montrera in vitro en 1996 que des phospholipides sont ainsi transportés d'une membrane donneuse à une membrane acceptrice[8].

Chez les végétaux ces petites protéines sont habituellement classées en 2 groupes :

1. Le groupe 1 (ou PTL 1 ou LPT 1) : C'est celui des PTL de poids moléculaires de 10kDa environ ; Elles sont basiques, car leur point isoélectrique se situe entre 9 et 10 (Les acides aminés chargés, très abondants, sont très souvent conservés au sein des LTP 1 (Aspartate, Arginine et Lysine) notent Castro et al. en 2003[9].
   Elles sont faites de 92 acides aminés environ (de 90 à 95). Elles sont caractérisées par la position, très conservée, de 8 résidus cystéine, qui forment 4 ponts disulfure, ce qui entraîne une très bonne stabilisation de la structure tertiaire[8].
   Leur structure secondaire se compose de 4 hélices a mais aussi d'une longue région C-terminale (queue) apparemment peu ou pas structurée [10] - [11]. Leur structure tridimensionnelle a été étudiées par diffraction aux rayons-X et par Résonance Magnétique Nucléaire (RMN), montrant un repliement globulaire, stabilisé par les ponts-disulfures[10] - [11]. C'est dans ce repliement que les lipides sont transportés. Des LTP 1 ont notamment été trouvées et étudiées sur les parois cellulaires de différentes plantes dont la plante-modèle Arabidopsis thaliana[12], ou le ricin (Ricinus communis[13]) ;

1. Le groupe 2 (ou PTL 2 ou LPT 2) : il rassemble des PTL plus courtes (70 acides aminés (7kDa) environ) mais dotées comme dans le groupe 1 d'un pI élevé, d'une activité de transfert de lipides, et de 4 ponts disulfure conservés)[9] - [14] - [15]. Elles ont le même profil de structure secondaire que les LTP 1, mais s'en différencient par le fait qu'elles ne forment que 3 hélices a et qu'elles présentent une région à 2 hélices plus courtes. La région C-terminale ne présente comme chez les PTL 1 aucune structuration particulière[14] - [16].

Elle diffère pour chacun des deux groupes :

1. Les PTL 1 disposent dans leur région centrale d'une cavité hydrophobe flexible formant un minuscule tunnel à 2 entrées (une petite et une large). Il est hydrophobe de ce tunnel parce que constitué de plusieurs résidus à chaînes latérales hydrophobes (notamment alanine, isoleucine, leucine, proline et valine)[10] - [11]. Deux acides aminés électropositifs (arginine et lysine) sont situés au voisinage de la plus grande entrée, interagissant avec les parties hydrophiles des lipides. La partie hydrophile des acides gras reste exposée au solvant et leur partie hydrophobe est aspirée dans le tunnel.
2. Chez les PTL 2, la cavité hydrophobe n'a pas la forme d'un tunnel, mais d'une cavité de section globalement triangulaire, dont les parois sont des acides aminés hydrophobe : alanine, cystéine, isoleucine, leucine, phénylalanine et valine[16]. Par modélisation moléculaire on voit que cette cavité pourrait être plus flexible que celle en tunnel des LTP 1, ce que confirme l'association de stérols avec des LTP 2 plutôt qu'avec des LTP 1[17] - [16].

En N-terminal, un peptide signal est présent dans les 2 familles. Dans le groupe 1, sa longueur varie de 21 à 27 acides aminés P 1 [18] - [19], contre 27 à 35 acides aminés dans le groupe 2 [20] - [21]. Quand le peptide signal est excisé, la LTP mature est exportée vers l'apoplaste.

Dans les deux groupes, les protéines PTL présente une certaines élasticité permettant d'adapter le volume de la cavité à différentes tailles de phospholipides (il n'y a pas de spécificité dans les interactions) ce pourquoi les LTP sont aussi dénommées Protéines de Transfert de Lipides non spécifiques (nsLTP)[22] - [16].

Chez les végétaux, elle varie selon les espèces ou essences, mais elle est toujours élevée (ex : 12 PTL connues dans le riz Oryza sativa[10], 11 trouvées dans le haricot mungo Vigna radiata var. radiate[23], 11 LTP 1 et 13 LTP 2 dans le mil Sorghum vulgare[24] et 11 LTP 1 dans le colza Brassica napus[10], et chacune de ces protéines peut transporter plusieurs types de molécules lipidiques.

Chez le végétaux, les protéines de transfert de lipides forment l'une des classes très importantes de défense PRPS, dont beaucoup ont des activités antimicrobiennes et enzymatiques, ou sont des inhibiteurs d'enzymes. Différentes protéines de cette classe peuvent présenter les activités suivantes[5] :

• antibactérien ;
• antifongique ;
• antiviral ;
• antiprolifératif.

Elles sont probablement encore incomplètement connues. On sait avec certitude depuis les années 1990 que chez les plantes une même protéine PTL peut avoir des fonctions différentes (car dans la cellule, plusieurs gènes codent des LTP[19] - [24] - [18]). Étudier ce qui déclenche l'expression de chacun de ces gènes, seuls ou combinés entre eux ou à d'autres gènes pourra éclairer les rôles précis de ces protéines mais cela demandera un important travail[25]

Le premier rôle à avoir été mis en évidence chez les végétaux est le transport des lipides de la membrane plasmique et des membranes des organelles, lipides qui ont un rôle dans de nombreux processus (catabolisme, transport de molécules, et métabolisme cellulaire). Ainsi le glyoxysome est un organite intracellulaire dont la membrane et faite de 3 types de lipides (phosphatidylcholine, phosphatidylglycérol et de phosphatidyléthanolamine) qu'il ne peut lui-même fabriquer, faute de la machine enzymatique permettant la synthèse de ces lipides. Ces trois lipides sont donc importés à partir du réticulum endoplasmique où ils ont été synthétisés. De même les membranes des chloroplastes et des mitochondries sont faites de lipides importés[26] ; ceci implique un système de transport intracellulaire spécifique, dédié aux lipides , en effet la plupart des lipides ne peuvent pas spontanément quitter une cellule ou y entrer en traversant sa membrane car leur hydrophobicité les rend peu solubles dans l'eau.
Les PTL permettent ou facilitent le mouvement des lipides entre cellules au travers des membranes en se liant et en les solubilisant. Chaque LTP est généralement spécifique d'un type de substrat, mais peut interagir avec une large variété de lipides [27], ce qui leur confère des fonctions élargies :

Chez les plantes supérieurs les PTL peuvent ainsi être impliqués dans :

• le métabolisme, transport et catabolisme des lipides ;
• la biosynthèse de la cutine ;
• la biosynthèse de cire protectrice, en surface de la cuticule foliaire ;
• la croissance mitochondriale ;
• les réactions de défense des plantes face à de nombreux agents pathogènes[1] ;
• l'adaptation aux changements environnementaux [28] - [1] ;
• la fertilisation des plantes à fleurs (on les retrouve dans le pistil et le grain de pollen, sous la cuticule protectrice) ;
• l'adaptation des plantes à certains facteurs de stress (stress induits par leurs pathogènes [1]) ;
• l'activation et la régulation de cascades de signalisation ;
• l'apoptose (suicide cellulaire);
• certaines symbioses ;
• la maturation des fruits[5]...

Structure de l'OsLTP1 (blanc) liée à un Acide palmitique (noir). Les ponts disulphides sont indiqués en jaune

Distribution des charges en surface de la PTL (positive en bleu et négative en rouge).

Vue en coupe montrant l'intérieur de la protéine, son tunnel, et la distribution des charges (positives en bleu, négative en rouge

PTL du riz (Oryza sativa) liée à une molécule d'acide palmitique. (PDB 1UVB)

Les protéines de transfert des lipides sont chez les végétaux de petite taille (10 kDa) et composées d’environ 90 acides aminés, formant 4 hélices alpha (α) insérées dans une super hélice droitière à topologie de feuille pliée qui a grossièrement la forme compacte repliée d'un petit saxophone. « Quatre ponts disulfure conservés qui relient les différentes régions de la chaîne polypeptidique assurant à ces protéines une résistance remarquable à la dénaturation thermique (cuisson) et à l’attaque des protéases digestives »[3]. Chacune de ces protéines forme une structure présentant une cavité hydrophobe interne où 1 à 2 lipides peuvent être liés et transportés. La surface externe de la protéine étant hydrophile, le complexe "protéine + lipide" devient soluble.Des interactions hydrophobes, et très peu d'interactions chargées, permettent à la protéine d'accepter une large gamme de lipides[27].

Cette résistance a été testée à la toute fin du XX^e siècle et dans les années suivantes : on savait déjà que ces protéines résistent à la congélation et assez bien à la cuisson (un chauffage à plus de 100 °C, ne détruit pas assez les LPTL de pêche et de maïs pour empêcher leur interaction avec les IgE de patients allergiques[29] - [30] - [31].

Introduites dans un environnement gastrique simulé (mise en contact avec la pepsine et d'autres enzymes digestives dans un environnement aussi acide que celui d'un estomac), elles sont encore intacts après 2 heures et seul 40% de l'allergène Pru p 3 avait été dégradé en 24 h[32] - [33] - [34] - [35].

Cette résistance explique que des jus de fruits (même pasteurisés par un choc thermique), des bières, du vin ou des confitures restent allergènes pour certaines personnes, bien que contenant des restes de fruits ou graines/malt fortement dénaturés[29] - [32] - [35] - [36] ; ils peuvent encore chez des personnes sensibilisées, causer des allergies aux PTL, qui vont d'une simple simple rhinite allergique à des cas plus sévères par exemple observées dans les pays du pourtour méditerranéen (urticaire généralisée, asthme, œdème, choc anaphylactique).

Ces niveaux varient selon l'espèce et selon le tissu et selon le stade de développement, mais aussi selon les conditions physiologiques et environnementales [18] - [37] - [38].

Par exemple le froid ou le stress salin modifient les profils d'expression de diverses LTP chez la plante ; de même quand elle est infectée par des bactéries ou champignons phytopathogènes[39] - [40].

Les molécules régulatrices pourraient notamment être l'acide abscissique, l'acide salicylique, l'éthylène (gaz) ou le jasmonate qui semblent impliqués dans les voies de signalisation activant l'expression des gènes de LTP [39] - [40] - [41] - [42]. Ce rôle a été confirmé par le génie génétique : par exemple l'introduction de LTP d'orge dans des sujets transgéniques d'arabette et de tabac (Nicotiana tabacum) a accru la tolérance à l'infection par un pathogène. Ce tabac transgénique retardait notamment la croissance de la bactérie Pseudomonas syringae pv. tabaci, tout en réduisant fortement le nombre de nécroses quantifiées chez les plantes infectées. De même A. thaliana résistait mieux à la bactérie P. syringae pv. tomato et aux attaques de champignon Botrytis cinerea[43]). Ces expériences intéressent beaucoup les partisans du génie génétique dans l'agroalimentaire, mais posent la question des risques de transferts d'allergénicité lors de transferts de gènes de résistances aux maladies impliquant des PTL.

Les PTL ont été classés au sein de la grande famille des protéines PR-14, en raison de leur activité antimicrobienne, leurs similarités de séquence et leur induction à la suite d'une infection par un phyto-pathogène. Certaines PTL ont une activité néanmoins très spécifique (ainsi la LTP purifiée du riz, exprimée chez E. coli est active contre la champignon Pyricularia oryzae mais pas du tout contre Xanthomonas oryzae[44].

En 1996, Kader postule que les LTP interagissent négativement avec le pathogène en perméabilisant sa membrane, ce qui a ensuite été confirmé par des expériences en laboratoire in vitro sur des membranes-modèles ou sur des levures vivantes[45] - [46] mais les mécanisme précis d'action anti-microbienne des LTP sont encore à éclaircir.

Chez la plante, les PTL semblaient toujours extracellulaires, mais il existe des contre-exemples, par exemple

• chez le ricin, où une isoforme de LTP a été retrouvée dans le glyoxysome, ce qui lui permettrait d'activer l'acétyl-CoA oxydase in vitro, suggérant une possible implication des LTP dans la b - oxydation et la régulation du transport et du stockage des lipides[13] ;
• dans le grain de blé où les vacuoles de stockage des graines de Niébé (Vigna unguiculata) en contiennent, de même que les grains d'aleurone contenus dans les grains de blé (alors que les LTP, en 1998 n'avaient toujours pas été retrouvées dans les parois cellulaires qui ont pourtant aussi besoin d'être défendues)[47] mais le rôle physiologique exact n'était en 2007 pas encore été expliqué[25].

l'expression du gène de la LTP 1 varie dans le temps et des LTP jouent parfois un rôle en surface de la feuille. Sur les jeunes feuilles de chou rouge (Brassica oleracea), les LTP constituent près de 50% des protéines présentes sur la cuticule cireuse des jeunes feuilles alors qu'elles ne sont que plus que 4% dans la feuille mature ; on suppose qu'elles transportent en surface le monomère de la cutine, lors de la croissance foliaire[48]. A. thaliana en produit également plus dans les tissus jeunes, sans doute aussi pour répondre au besoin de cutine nécessaire à la croissance foliaire et d'autres organes de la plante[49]. On a montré en 1991 que la PTL transporte bien la cutine dans ce cas pour former la membrane lipophilique qui protège les cellules embryonnaires[50] - [51]

C'est une hypothèse défendue par plusieurs auteurs [52] - [53], qui reste à expliciter, mais qui a été suscitée par plusieurs observations :

• Chez A. thaliana, un gène (dir1-1, très proche de celui des PTL) joue un rôle dans la transmission du signal intracellulaire ; Ce gène code une protéine de 102 acides aminés, laquelle interagi avec des lipides pour produire un complexe impliqué dans la résistance systémique des plantes face à leur spathogènes[54] ;
• Chez le Tabac, on observe (in vitro) aussi une interaction de la LTP de blé avec des récepteurs des élicitines[55] qui sont de petites protéines (+/-10kDa) produites par des Oomycètes du genre Phytophthora ou Pythium ; introduites chez le tabac, elles y induisent une réaction d'hypersensibilité[56]. Or, à la manière des PTL, les élicitines sont de petites protéines basiques possédant des ponts disulfure et une structure secondaire constituée surtout d'hélices a, qui forment également une poche hydrophobe permettant de capter des molécules hydrophobes (stérols notamment) ;
• une LTP recombinante de tabac fixant l'acide jasmonique forme un complexe reconnu par le récepteur des élicitines[57]. Une fois infiltré dans des plants de tabacs, ce complexe y crée une protection systémique (c'est-à-dire de toutes les parties de la plante) contre plusieurs agents pathogènes (dont P. parasitica) ; en 2004, on ignore cependant si ce complexe est le signal d'activation, ou s'il ne fait qu'indirectement activer une voie de signalisation encore à découvrir.

Les protéines de transfert des lipides des plantes partagent le même domaine structural [58] que les protéines de stockage des graines [59] et les inhibiteurs de la trypsine alpha-amylase[60] - [61] Ces protéines partagent le même faisceau de quatre hélices stabilisé au disulfure superhélique contenant une cavité interne.

Il n'y a pas de similarité de séquence entre les PTL d'origine animale et végétale. Chez les animaux, la protéine de transfert du cholestérol (LTC), également appelée protéine de transfert des lipides plasmatiques, est une protéine plasmatique facilitant le transport des esters et des triglycérides du cholestérol entre les lipoprotéines.

De nombreuses protéines de défense biosynthétisées par les plantes sont sensibilisantes et/ou allergisantes : c'est le cas par exemple des chitinases, des protéines Bet v 1-like mais aussi des protéines de transfert lipidique PTL. Leur impact allergique et l'effet de certains procédés agricoles ou technoalimentaires sur l'allergénicité des aliments végétaux font l'objet d'études.

La protéine de transfert lipidique 1 (de l’orge) est responsable, lorsqu’elle est dénaturée par le processus de brassage, de la majeure partie de la mousse qui se forme sur la bière[67].