Séquençage des protéines

Les acides aminés (AA) s'assemblent grâce à des liaisons peptidiques (groupement acide carboxylique d'un AA avec le groupement amine d'un AA voisin → C=O—NH), et forment ainsi la structure primaire. La liaison peptidique est plane dans l'espace et les radicaux sont en opposition. La structure primaire ne permettra d'avoir uniquement les enchainements d'acides aminé. Celle-ci n'a pas de propriété physiologique particulière.

La structure secondaire peut se manifester sous deux formes:

• Élément A : L'hélice ${\displaystyle \alpha }$ (en spirale – exemple : la kératine alpha ). Ce sont les protéines fibreuses.
• Élément B : Le feuillet plissé ${\displaystyle \beta }$ (en escalier – exemple : la kératine beta ). Ce sont les protéines globulaires.

Cette structure est due à l'existence de liaisons hydrogène qui se forment entre des liaisons peptidiques voisines.

Soit le feuillet plissé ${\displaystyle \beta }$, soit l'hélice ${\displaystyle \alpha }$ s'assemblent en structure tertiaire[1] par des liaisons secondaires qui se créent entre les radicaux des acides aminés qui, lors de la formation de la structure secondaire, se sont retrouvés à l'extérieur de la structure (exemples : liaison saline, hydrogène, pont disulfure). Ces liaisons, hormis le pont disulfure qui est une liaison covalente forte, sont des liaisons faibles.

Ce repliement de la chaîne peptidique amène la création d'un site actif responsable de l'activité biologique de la protéine. (cf Enzymes)

Certaines protéines, dites oligomériques (constituées par plusieurs chaînes de polypeptides – chaque chaîne présente une structure primaire, secondaire et tertiaire), telle que l'hémoglobine par exemple, atteignent une structure quaternaire en adoptant une construction symétrique et paire par l'association de ces différents protomères. Ces protéines ne voient la création de leur site actif que lorsque cette structure a été atteinte.

• Perte de l'activité biologique
• Changement des propriétés optiques
• Perte de la solubilité car précipitation

Ils sont nombreux et peuvent être physiques ou chimiques. On utilise certains de ces agents dénaturants pour obtenir une structure primaire, utile au séquençage des protéines (détermination de l'ordre des acides aminés dans la chaine peptidique).

• Température : toute augmentation de la température provoque une rupture des liaisons hydrogène.
• Modification de pH : elle entraîne une modification des charges portées par les groupements ionisés, d'où une rupture de ces liaisons.

• L'urée et le SDS (détergent) : rupture des liaisons faibles, le SDS ajoute en outre une charge négative à chaque résidu.
• Le ${\displaystyle \beta }$ mercaptoéthanol, le DTT et l'acide performique : rupture des ponts disulfures.
• Les bases et détergents provoquent une forte dénaturation protéique.
• Les défécants : précipitation des protéines (défécation)
• Le bromure de cyanogène (BrCN) : clive la méthionine côté C-terminal.

In vitro : pour les extractions d'enzymes, on évite les dénaturations. Mais pour une stérilisation, on les provoque.

C'est également en faisant agir des dénaturants sur des protéines que l'on va pouvoir les séquencer.

La rupture des ponts disulfure entre les cystéines est avant tout une dénaturation chimique, qui est de plus essentielle pour pouvoir séparer les différents groupes d'acides aminés. On utilise à cet effet des agents réducteurs porteurs de fonctions thiol (–SH), comme le β-mercaptoéthanol ou le dithiothréitol (réactif de Cleland). Il existe également des réducteurs non-thiolés comme le TCEP (Tris (2-carboxyethyl) phosphine). Il faut savoir également que deux cystéines sont réunies par leur groupement thiol (–SH), et forment alors une molécule appelée cystine. La cystéine est un acide aminé, elle peut donc être dénaturée. Le pont disulfure est responsable de la structure tertiaire des protéines, apportant une grande stabilité à cette dernière.

L'hydrolyse des liaisons peptidiques permet de séparer les différents acides aminés, car elles sont responsables de la structure primaire, agissant entre le groupement carboxyle d'un acide aminé (C=O) et le groupement amine (NH2) d'un AA (acide aminé) voisin.

• Hydrolyse totale acide :
  • Utilisation d'acide chlorhydrique (HCl) à 6 mol/L à chaud (110 °C) et pendant 24h environ.
  • L'hydrolyse acide totale détruit le tryptophane et transforme en acide les fonctions amides de la glutamine et de l'asparagine pour donner du glutamate et de l'aspartate.

• Hydrolyse totale alcaline :
  • Utilisation d'hydroxyde de sodium (NaOH) à 4 mol/L à chaud (110 °C) pendant 24h environ.
  • L'hydrolyse totale alcaline détruit la sérine, la thréonine, la cystéine.

L'hydrolyse totale acide détruisant moins d'acides aminés, elle est en conséquence la méthode d'hydrolyse la plus utilisée.

Après rupture des liaisons disulfures au 2-mercaptoéthanol et une hydrolyse, l'hydrolysat est déposé sur une résine échangeuse d'anions ou de cations. Une fois les fractions récupérées on les colore à la ninhydrine et on mesure l'absorbance à 570nm. On obtient finalement une estimation du pourcentage de chaque acide aminé contenu dans la chaîne (% de résidus alanine...). La détermination de cette composition n’est pas nécessaire pour déterminer la séquence et est de fait de moins en moins pratiquée.

• La première méthode utilise la réaction de Sanger (cf. arylation). Les fonctions 2-amine des acides aminés et peptides réagissent avec le 2,4-dinitrofluorobenzène pour former des dérivés jaunes, les 2,4-dinitrophényl-peptides. Lorsque ces composés sont soumis à une hydrolyse acide, toutes les liaisons peptidiques sont hydrolysées, mais la liaison entre la fonction 2,4-dinitrophényl et la fonction amine de l'acide aminé N-terminal reste stable. On pourra par la suite identifier cet acide aminé, par chromatographie par exemple.

• La deuxième méthode utilise le chlorure de dansyle, qui, combiné à une hydrolyse totale acide forme un Dansyl-AcideAminé1 (DNS-aa) qui est fluorescent et un hydrolysat.

• Une troisième méthode est celle d'Edman, dans laquelle le phénylisothiocyanate (PITC) réagit avec la fonction amine N-terminale pour donner un complexe qui, après action d'un acide dans des conditions douces libère une phénylthiohydantoïne et le peptide restant intact (cf. carbamylation). Les deux premières méthodes utilisant une hydrolyse totale acide, le reste de la chaîne peptidique voit ses acides aminés clivés. Le grand avantage de la méthode d'Edman est que la chaîne peptidique reste intacte et peut être récupérée et soumise à nouveau au traitement avec le PITC.

On utilise l'hydrazinolyse, qui coupe les liaisons à 100 °C et donne un acide aminé libre. On peut également utiliser des carboxypeptidases qui coupent l'extrémité C-terminale, il en existe plusieurs types:

• la carboxypeptidase A, qui coupe, en C-terminal tous les acides aminés sauf la lysine, l'arginine, la glycine et la proline. Elle est aussi, bloquée quand la proline précède l'acide aminé C-terminal.
• la carboxypeptidase B, ne libère que la Lys, l'Arg et l'aminoéthyl Cystéine quand la proline n'occupe pas la position n-1.

Il existe également des méthodes biochimiques utilisant des enzymes capable de couper le premier ou le dernier acide aminé de la chaîne polypeptidique, on les appelle des exopeptidases. Les aminopeptidases clivent la liaison peptidique située juste après le premier acide aminé et libèrent celui-ci. De manière symétrique, les carboxypeptidases clivent la liaison peptidique située juste avant le dernier acide aminé.

Il en existe plusieurs de ces enzymes de spécificités variées, par exemple parmi les carboxypeptidases, on trouve :

• La carboxypeptidase A, clive l'acide aminé C-terminal lorsque celui-ci est aromatique ou aliphatique
• La carboxypeptidase B, clive l'acide aminé C-terminal lorsque celui-ci est basique (Arginine ou Lysine)
• La carboxypeptidase Y à spectre large

En analysant les acides aminés libérés par ces enzymes, il est possible d'analyser la séquence N ou C-terminale de la protéine.

La chaîne polypeptidique est découpée en une série de petits peptides par des hydrolyses enzymatiques ou chimiques.

L'hydrolyse chimique la plus utilisée implique une réaction avec le bromure de cyanogène, qui scinde les liaisons peptidiques dans lesquelles la fonction carboxyle est fournie par des résidus de méthionine.

L'hydrolyse enzymatique utilise les protéases, enzymes qui hydrolysent les liaisons peptidiques. La trypsine catalyse l'hydrolyse des liaisons peptidiques dans lesquelles la fonction carboxyle est fournie par la lysine ou l'arginine, la chymotrypsine permet la coupure du côté C-terminal des acides aminés aromatiques (Phe, Trp et Tyr).

• Trypsine (C) : LYS, ARG (sauf si PRO à droite)
• Chymotrypsine (C) : PHE, TRP, TYR, (sauf si PRO à droite)
• Thermolysine (N) : MET, PHE, TYR, TRP, ILE, VAL (sauf si PRO à gauche)
• Pepsine (N) : PHE, TRP, TYR, LEU (sauf si PRO à gauche)
• LysC
• Papaïne : très utilisée dans l’industrie agro-alimentaire et chimique, elle permet notamment en boucherie d’attendrir la viande. Elle est aussi utilisée dans les produits de nettoyages de verres de contact, ainsi que dans les poudres à lessive, où son action est de détruire les protéines responsables des taches.
• Clostripaïne [Arginine[ARG]
• Subtilisine
• Elastase
• etc.

L'identification de la séquence se fait de manière logique à partir des résultats obtenus par l'utilisation des différentes méthodes décrites précédemment.

La fragmentation par spectrométrie de masse MS/MS permet de séquencer des courtes séquences d'acides aminés (10 à 20). Couplée avec les techniques de digestion des protéines précédemment décrite, il est ainsi possible de connaitre la séquence d'une protéine. Cependant, cette approche nécessite d'utiliser différents protocoles de digestion différents pour espérer obtenir l'ensemble de la séquence de la protéine.

Pour un organisme dont le génome est entièrement connu, on utilisera un seul type de digestion (par exemple une digestion par la trypsine suivie d'une analyse par HPLC couplée à un spectromètre de masse de type ESI-MS/MS), ce qui permet d'obtenir jusque 30 % de la séquence de la protéine (ce qui est suffisant pour caractériser la protéine).

Pour un organisme dont le génome n'est pas entièrement connu, on utilise en première intention un séquençage automatisé (séquençage d'Edman par exemple).