Glycéraldéhyde-3-phosphate

	${\displaystyle \rightleftharpoons }$		+				${\displaystyle \rightleftharpoons }$
Fru-1,6-DP		G3P		DHAP		DHAP		G3P
Fructose-bisphosphate aldolase – EC 4.1.2.13						Triose-phosphate isomérase – EC 5.3.1.1

Le β-D-fructose-1,6-bisphosphate produit au cours de la glycolyse est clivé par une lyase, la fructose-bisphosphate aldolase, en D-glycéraldéhyde-3-phosphate (G3P) et dihydroxyacétone phosphate (DHAP) ; cette dernière molécule est alors isomérisée en glycéraldéhyde-3-phosphate par la triose-phosphate isomérase. Ainsi, chaque molécule de fructose-1,6-bisphosphate donne en fin de compte deux molécules de glycéraldéhyde-3-phosphate.

Il existe deux classes d'aldolases susceptibles de cliver le β-D-fructose-1,6-bisphosphate : la classe I chez les animaux et les plantes, et la classe II chez les mycètes et les bactéries ; ces deux classes d'enzymes utilisent des mécanismes différents pour cliver ce cétose.

	+ NAD+ + Pi ${\displaystyle \rightleftharpoons }$ NADH + H+ +
G3P		1,3-BPG
Glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase – EC 1.2.1.12

Le G3P est phosphorylé en 1,3-bisphospho-D-glycérate (1,3-BPG) par la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase avec réduction concomitante d'une molécule de NAD⁺ en NADH + H⁺ ; c'est la seule étape de la glycolyse où il est formé du pouvoir réducteur, sous forme de NADH + H⁺. Cette réaction est équilibrée du point de vue de la charge électrique et du nombre d'atomes d'hydrogène par le fait que le phosphate inorganique (Pi) existe, dans le milieu cytoplasmique, sous forme d'ion hydrogénophosphate HPO₄²⁻.