Microscopie de seconde harmonique

La fluorescence à deux photons (2PEF) est un processus très différent de la SHG: elle implique une excitation d'électrons vers des niveaux d'énergie plus élevés, et une désexcitation subséquente par émission d'un photon (contrairement à la SHG, bien qu'elle soit aussi un processus à 2 photons). Ainsi, la 2PEF est un processus non cohérent, spatialement (émission isotrope) et temporellement (large spectre, dépendant de l'échantillon). Elle n'est pas non plus spécifique à certaines structures, contrairement à la SHG[5].

La 2PEF peut donc être couplée à la SHG en imagerie multiphotonique pour révéler certaines molécules qui produisent de l'autofluorescence, telle que l'élastine dans les tissus (alors que la SHG révèle le collagène ou la myosine par exemple).

L'anisotropie de la polarisation en SHG peut être utilisée pour déterminer l’orientation et le degré d’organisation des protéines dans les tissus, puisque les signaux SHG ont des polarisations bien définies. En utilisant l'équation d'anisotropie[18]:

${\displaystyle {\frac {I_{par}-I_{perp}}{I_{par}+2I_{perp}}}=r}$

et en acquérant les intensités des polarisations dans les directions parallèle et perpendiculaire au plan du laboratoire (convention), on peut calculer ${\displaystyle r}$. Un ${\displaystyle r}$ élevé indique une orientation plutôt anisotrope, tandis qu'une valeur de ${\displaystyle r}$ faible indique une structure isotrope. Dans les travaux menés par Campagnola et Loew[18], il a été constaté que les fibres de collagène formaient des structures bien alignées avec ${\displaystyle r=0.7}$.

La SHG étant un processus cohérent ( spatialement et temporellement), il conserve des informations sur la direction de l'excitation et n'est pas émis de manière isotrope. Elle est principalement émise vers l'avant (forward, comme pour l'excitation), mais peut également être émise vers l'arrière (backward) en fonction de la condition d'accord de phase. En effet, la longueur de cohérence au-delà de laquelle conversion du signal diminue est: ${\displaystyle l_{c}=2/\Delta k}$

avec ${\displaystyle \Delta k\propto 1/(n_{2\omega }-n_{\omega })}$ pour le forward, mais ${\displaystyle \Delta k_{bwd}\propto 1/(n_{2\omega }+n_{\omega })}$ pour le backward si bien que ${\displaystyle l_{c}}$ >> ${\displaystyle l_{c,bwd}}$. Par conséquent, des structures plus épaisses seront visibles préférentiellement vers l'avant (forward), et les plus minces vers l'arrière (backward): puisque la conversion de la SHG dépend en première approximation du carré du nombre d'harmonophores, le signal sera plus élevé s'il est émis par des structures épaisses, donc le signal avant sera supérieur au signal arrière. Cependant, le tissu peut diffuser la lumière générée et une partie de la SHG vers l'avant peut être rétroréfléchie vers l'arrière[19].

Ensuite, le rapport avant/arrière F/B peut être calculé[19], et est une métrique de la taille globale et de la disposition des harmonophores (généralement des fibrilles de collagène). On peut également montrer que plus l'angle hors-plan du diffuseur est élevé, plus son rapport F/B est élevé (voir fig. 2.14 of[20]).

Les avantages de polarimétrie ont été couplés à la SHG en 2002 par Stoller et al[21]. La polarimétrie sert à mesurer l'orientation et l'ordre au niveau moléculaire, et couplée à la SHG, elle peut le faire avec une spécificité à certaines structures comme le collagène : la microscopie SHG résolue en polarisation (p-SHG) est donc une extension de la microscopie SHG[22]. La p-SHG définie un autre paramètre d'anisotropie tel que[23]:

${\displaystyle \rho ={\sqrt {\frac {I_{par}}{I_{perp}}}}}$

qui est, comme r, une mesure de l'orientation principale et du désordre de la structure imagée. Comme elle est souvent réalisée dans de longs filaments cylindriques (comme le collagène), cette anisotropie est souvent égale à ${\displaystyle \rho ={\frac {\chi _{XXX}^{(2)}}{\chi _{XYY}^{(2)}}}}$ [24], où ${\displaystyle \chi ^{(2)}}$ est la susceptibilité électrique non-linéaire et X la direction du filament (ou la direction principale de la structure), Y est orthogonal à X et Z est la direction de propagation de la lumière d'excitation.

L'orientation ϕ des filaments dans le plan XY de l'image peut également être extraite grâce à la p-SHG par une analyse FFT, et utilisée comme un contraste sur une image[24] - [25].

Le collagène (cas particulier, mais largement étudié en microscopie SHG), peut exister sous différentes formes : 28 types différents, dont 5 fibrillaires. L'un des défis consiste à caractériser et à quantifier le collagène fibrillaire dans un tissu, pour pouvoir voir son évolution et sa relation avec d'autres composantes du tissu[26].

Pour cela, une image de microscopie SHG doit être corrigée pour éliminer la petite quantité de fluorescence ou de bruit résiduel qui existe à la longueur d'onde SHG. Après cela, un masque numérique peut être appliqué pour quantifier le collagène à l'intérieur de l'image[26]. Parmi les différentes techniques de quantification, c'est probablement celle qui a la spécificité, la reproductibilité et l'applicabilité la plus élevée, bien qu'elle soit assez complexe[26].

La microscopie SHG a également été utilisée pour montrer que les potentiels d'action se propageant en sens inverse entrent dans les épines dendritiques sans atténuation de tension, établissant ainsi une base solide pour des travaux futurs sur l'imagerie des neurones par SHG. L'avantage ici est la mesure de tension dans les dendrites avec une précision inaccessible avec la microscopie standard à deux photons[27].

La densité mammographique est corrélée avec celle du collagène : la microscopie SHG peut donc servir à identifier le cancer du sein[35]. La SHG est généralement couplée à d'autres techniques non linéaires telles que la microscopie CARS (en) ou la microscopie deux photons, pour former la microscopie multiphotonique (ou tomographie) qui fournit un diagnostic in vivo non invasif et rapide (comme l'histologie) de biopsies pouvant être cancéreuses[36].

La comparaison des images SHG avant et arrière donne un aperçu de la microstructure du collagène, elle-même liée à la gravité et au stade d'une tumeur[37]. La comparaison des images SHG et de microscopie deux photons (autofluorescence) peuvent aussi montrer le changement d'orientation du collagène dans les tumeurs[38].

Même si la microscopie SHG a beaucoup contribué à la recherche sur le cancer du sein, elle n'est pas encore établie comme une technique fiable en médecine ou pour le diagnostic de pathologies en général[37].

Les ovaires saines présentent une SHG uniforme dans leur couche épithéliale et un collagène bien organisé dans leur stroma, alors que l'épithélium aura de grandes cellules et une structure de collagène modifiée dans les ovaires cancéreuses[37]. Le ratio r (voir anisotropie d'orientation) est aussi utilisé[39] pour montrer que l'alignement des fibrilles est légèrement plus élevé pour les tissus cancéreux que pour les tissus normaux.

La SHG est, encore ici, combinée à la microscopie deux photons pour calculer le ratio :

${\displaystyle MFSI=({\text{shg}}-{\text{tpef}})/({\text{shg}}+{\text{tpef}})}$

où shg (resp. tpef) est le nombre de pixels dépassant un certain seuil (en intensité) dans l'image SHG (resp. 2PEF de fluorescence)[40], un MFSI élevé signifiant une image SHG pure (sans fluorescence). Le MFSI le plus élevé est mesuré pour les tissus cancéreux[37], ce qui fournit un mode de contraste pour les différencier des tissus normaux.

La SHG a également été combinée à génération de troisième harmonique (THG) pour montrer que le signal epi-THG (voir rapport F/B) est plus élevé dans les tumeurs[41].

La SHG a été utilisée pour l'étude des cancers du poumon, du côlon, du stroma œsophagien, du col utérin et du pancréas[37].

Des altérations de l'organisation ou de la polarité des fibrilles de collagène peuvent être des signes directs de pathologie[42] - [43].

En particulier, l'anisotropie d'alignement des fibres de collagène a permis de discriminer le derme sain de cicatrices pathologiques dans des échantillons de peau[44]. De plus, les pathologies du cartilage telles que l'arthrose peuvent être sondées par microscopie SHG résolue en polarisation[45] - [46]. La SHIM a ensuite été étendue au fibrocartilage (ménisque)[47].

La capacité de la SHG à imager des molécules spécifiques peut servir à révéler la structure de certains tissus une seule composante à la fois, et à différentes échelles (de macro à micro) en utilisant la microscopie. Par exemple, le collagène (type I) est spécifiquement imagé à partir de la matrice extracellulaire (ECM) des cellules, ou lorsqu'il sert de matériau conjonctif dans les tissus[48]. La microscopie SHG révèle également la fibroïne dans la soie, la myosine dans les muscles et la cellulose biosynthétisée. Toutes ces capacités d'imagerie peuvent être utilisées pour concevoir des tissus artificiels, en ciblant des points spécifiques du tissu : la SHG peut en effet servir à mesurer quantitativement certaines orientations, ainsi que la quantité et l'arrangement des matériaux[48]. De plus, la SHG couplée à d'autres techniques multiphotons peut servir à surveiller le développement de tissus synthétiques, lorsque l'échantillon est relativement mince cependant[49]. Bien entendu, ces techniques peuvent enfin être utilisés comme contrôle qualité des tissus fabriqués[49].

La cornée, à la surface de l'œil, est considérée comme étant constituée d'une structure de collagène semblable à un assemblage en couches, en raison des propriétés d'auto-organisation du collagène dense[50]. Pourtant, l'orientation cornéale du collagène en lamelles fait encore débat[51].

Le kératocône cornéen peut également être visualisé par microscopie SHG pour révéler des altérations morphologiques du collagène[52]. La microscopie par génération de troisième harmonique (THG) est en outre utilisée pour imager la cornée, qui est complémentaire au signal SHG car les maxima THG et SHG dans ce tissu sont souvent à des endroits différents[53].