Expression hétérologue

L'identification des gènes peut être réalisée à l'aide de méthodes informatiques connues sous le nom de techniques de criblage hétérologue[2]. Une bibliothèque numérique de séquences d'ADNc contient des données provenant de nombreux projets de séquençage et permet d'accéder facilement aux informations sur les séquences de gènes connus.

Si une séquence génomique est inconnue ou indisponible, l'ADN est soumis à un processus de fragmentation aléatoire, de clonage et de criblage afin de déterminer son phénotype[3]. Bien que diverses méthodes puissent être utilisées pour obtenir un gène particulier, la manière la plus simple de révéler les composants d'une séquence d'ADN inconnue est d'abord d'identifier ses enzymes de restriction. Les enzymes de restriction sont des enzymes responsables du clivage de l'ADN en fragments sur un site spécifique au sein de molécules appelées sites de restriction. Ces enzymes peuvent se trouver dans des bactéries ou des archées et sont connues pour protéger l'ADN de l'invasion étrangère des virus. Les enzymes de restriction sont distinctes et chacune ne reconnaît qu'une séquence spécifique de paires de bases dans l'ADN, dont beaucoup ont tendance à être palindromiques. En localisant chaque enzyme, la séquence associée à l'enzyme de restriction peut être identifiée et isolée.

Si la séquence est connue, une technique appelée réaction en chaîne par polymérase (PCR) peut être utilisée pour isoler un gène d'intérêt. L'objectif de la PCR est non seulement d'identifier, mais aussi d'amplifier un segment d'ADN particulier par des phases de dénaturation, de recuit et d'extension. La dénaturation place une matrice d'ADN double brin dans des conditions de température élevée (95 °C) afin de rompre ses faibles liaisons hydrogène et d'assurer la séparation des brins. Le recuit refroidit la réaction pour permettre aux liaisons hydrogène de se reformer et favoriser la liaison des amorces à leurs séquences complémentaires sur la matrice d'ADN simple brin. Enfin, l'étape d'extension implique que l'ADN polymérase reconnaissant l'ADN simple brin amorcé, et donc isolant des séquences spécifiques nécessaires à la réplication[3].

L'administration par pistolet à gènes /biolistique est une méthode attrayante pour l'administration de gènes en raison de ses propriétés non virales et, en plus de la transduction virale, c'est l'une des méthodes les plus courantes. Cette méthode permet de réduire les réactions immunitaires indésirables et le risque d'infection virale par rapport aux méthodes de transfert basées sur les virus. Plutôt que d'utiliser un vecteur viral, cette technique fait appel à des méthodes physiques, en particulier à la propulsion à l'hélium pour délivrer des vecteurs de transformation. Le transfert par canon à gènes est traditionnellement utilisé pour la production de plantes transgéniques, car il permet de pénétrer efficacement les parois cellulaires. Plus récemment, cette technique s'est avérée efficace dans les cellules animales qui ne peuvent tolérer un bombardement de haut niveau, où les particules d'or de l'ADN sont délivrées à une pression d'hélium plus faible. Cette méthode est utilisée avec succès à la fois in vitro et in vivo[4].

L'électroporation est une méthode qui utilise une haute tension pour créer des pores dans les membranes des cellules de mammifères. En pulsant l'électricité, des zones locales de la membrane cellulaire se déstabilisent transitoirement et l'ADN peut alors pénétrer dans la cellule. Lorsque l'intensité du champ est appropriée, les dommages causés à la cellule hôte sont minimes[5]. Cette technique peut être utilisée pour les transfectants à court et à long terme[6]. Elle est également efficace avec presque tous les types de tissus et a montré des niveaux élevés de transfert de gènes avec une augmentation de la distribution des cellules exprimant l'ADN[5].

La transduction virale est une méthode qui fait appel à des vecteurs viraux et qui est utilisée pour l'introduction stable de gènes dans les cellules cibles. Dans cette méthode, le vecteur viral (virion) infecte les cellules hôtes en transportant directement l'ADN dans le noyau de la cellule. Les deux types de virus couramment utilisés pour la transduction sont les adénovirus, qui ont tendance à être transitoires, et les lentivirus, qui intègrent l'ADN dans le génome. Les vecteurs lentiviraux sont également un outil viral intéressant car ils peuvent transduire dans des cellules qui ne se divisent pas, ce qui permet un transfert stable dans une large gamme de types de cellules hôtes[7].

Dans la lipofection, le gène est injecté à l'aide de liposomes. La séquence d'ADN est encapsulée dans un liposome dont la composition est identique à celle de la membrane cellulaire. Cette méthode lui permet de fusionner directement avec la membrane ou d'être endocytosé, ce qui libère l'ADN dans la cellule. La lipofection est souvent utilisée parce qu'elle fonctionne avec de nombreux types de cellules, qu'elle est hautement reproductible et qu'il s'agit d'une méthode rapide pour l'expression stable et transitoire[8].

Un système populaire utilisé est Escherichia coli en raison de son taux de croissance rapide (~ 20 à 30 minutes), de sa capacité de fermentation continue et de son coût relativement faible[9]. En outre, la levure a la capacité d'exprimer un volume relatif élevé de protéines hétérologues. Plus précisément, jusqu'à 30 % des protéines produites dans la levure peuvent être le produit d'un gène hétérologue. Il existe également des souches sûres d'E. coli qui sont générées avec succès pour augmenter la production. Outre les propriétés attrayantes d'E. coli en tant qu'hôte, cet hôte est incroyablement populaire car les chercheurs disposent d'une grande quantité de connaissances sur sa génétique, y compris la séquence génomique complète. Cependant, des problèmes se posent, soit en raison de la séquence du gène d'intérêt, soit en raison des limites d'E. coli en tant qu'hôte. Par exemple, les protéines exprimées en grandes quantités dans E. coli ont tendance à précipiter et à s'agréger, ce qui nécessite alors une autre méthode de dénaturation, de renaturation et de récupération. Enfin, E. coli n'est optimale que dans des conditions spécifiques qui dépendent du gène inséré.

Bacillus subtilis (B. subtilis) est un organisme gram positif non pathogène qui ne produit pas de lipopolysaccharides Les LPS, que l'on trouve dans les bactéries à Gram négatif, sont connus pour provoquer de nombreux troubles dégénératifs chez l'homme et l'animal et pour affecter la production de protéines chez E. coli. Par conséquent, bien qu'il soit considéré comme potentiellement sûr, B. subtilis n'est pas officiellement classé comme étant généralement considéré comme sûr par la FDA (GRAS). B. subtilis possède des caractéristiques génétiques qui lui permettent de se transformer facilement avec des bactériophages et des plasmides[11]. De plus, il peut faciliter davantage d'étapes de purification par sécrétion directe dans le milieu de culture et peut facilement être mis à l'échelle en raison de sa capacité à sécréter ces protéines de manière non spécifique. À ce jour, B. subtilis est utilisée avec succès pour étudier différents mécanismes biologiques, notamment le métabolisme, la régulation des gènes, la différenciation, l'expression des protéines et la génération de produits bioactifs. Il s'agit également de la bactérie gram-positive la plus étudiée au monde, les informations génomiques étant largement disponibles. Parmi les inconvénients de ce système hôte, citons la réduction ou la non-expression de la protéine d'intérêt et la production de protéases extracellulaires dégradantes qui ciblent les protéines hétérologues. Enfin, malgré les propriétés attrayantes de B. subtilis, ces limitations font que E. coli est le système hôte par défaut par rapport à B. subtilis. Cependant, avec davantage de recherche et d'optimisation, B. subtilis a le potentiel de produire des protéines membranaires à grande échelle[12].

Les cellules eucaryotes peuvent être utilisées comme alternative à l'expression procaryote des protéines destinées à un usage thérapeutique. La levure est un champignon unicellulaire qui utilise des niveaux d'expression élevés, une croissance rapide et une maintenance peu coûteuse, comme les systèmes procaryotes. La levure étant un organisme alimentaire, elle est également favorable à la production de produits pharmaceutiques, contrairement à E. coli qui peut contenir des toxines. La levure a également un taux de croissance relativement rapide, avec un temps de doublement de 90 minutes sur des milieux simples, et est facilement manipulable. Comme pour E.coli, la séquence génomique complète de la levure est disponible. La levure la plus couramment utilisée est S. cerevisiae, qui peut effectuer des modifications post-traductionnelles telles que le traitement et le repliement des protéines. S. cerevisiae, P. pastoris sont de simples organismes eucaryotes qui se développent rapidement et sont hautement adaptables[13]. Les systèmes eucaryotes ont des applications humaines et ont réussi à fabriquer des vaccins contre l'hépatite B et l'Hantavirus. L'utilisation de cellules de mammifères pour la technologie recombinante et la synthèse d'activités biologiques complètes augmente progressivement. Ce système sécrète et glycosyle les protéines, tout en introduisant un repliement correct des protéines et des modifications post-traductionnelles. Cependant, lorsque des capacités de glycosylation accrues sont utilisées, on observe souvent une hyper-mannosylation, ou l'ajout d'un grand nombre de mannose. Cela entrave le repliement correct des protéines. Dans l'ensemble, la levure est un compromis entre les cellules bactériennes et mammifères, et reste un système hôte populaire. Le coût de production pour l'utilisation de la levure comme système d'expression est élevé en raison de sa croissance lente et de ses besoins en nutriments coûteux.

Les baculovirus sont des virus qui infectent les insectes et sont apparus comme un système d'expression hétérologue chez les eucaryotes - les insectes. En tant qu'eucaryote, ils ont plusieurs fonctions importantes qui ne sont pas présentes dans les systèmes de levure et de bactérie, notamment la modification et le traitement des protéines et le système de transport eucaryote. Comme ils peuvent être reproduits en très fortes concentrations, cela simplifie le processus d'obtention de grandes quantités de protéines recombinantes. En outre, les chercheurs ont constaté que les protéines exprimées sont généralement localisées dans leurs compartiments respectifs et sont faciles à récolter. Ces génomes ont également tendance à être très grands et peuvent incorporer des fragments plus importants par rapport aux systèmes procaryotes, et ne sont pas infectieux pour les vertébrés et les cellules de mammifères. Cependant, ces vecteurs baculoviraux sont soumis à des limitations. Comme ces virus infectent à l'origine des invertébrés, il pourrait y avoir des différences dans le traitement des protéines chez les vertébrés, ce qui entraînerait des modifications néfastes[14].

L'ovocyte non fécondé d'une grenouille, ou Xenopus laevis, a également été utilisé comme système d'expression hétérologue. Initialement utilisé pour exprimer le récepteur de l'acétylcholine en 1982, il a depuis été utilisé pour diverses raisons. Ces ovocytes sont produits par les grenouilles tout au long de l'année et sont donc relativement abondants, et la traduction se fait avec une grande fidélité. Parmi les nombreuses limitations du système ovocytaire, l'une des principales est que les protéines hétérologues produites interagissent avec les protéines de l'ovocyte de grenouille, ce qui modifie son comportement par rapport à ce qu'il serait dans une cellule de mammifère. En outre, alors que les mammifères sont diploïdes, ces xénopes ont quatre copies homologues de chaque chromosome et les protéines dérivées peuvent donc avoir une fonction différente. Des recherches supplémentaires sont nécessaires pour examiner la production de protéines des systèmes de X. laevis[15].

Bien que les cellules de mammifères soient plus difficiles à cultiver, prennent plus de temps, nécessitent plus de nutriments et sont nettement plus coûteuses, une protéine qui nécessite des modifications post-traductionnelles doit être exprimée dans des cellules de mammifères pour protéger l'efficacité clinique et la fidélité du produit. Cependant, même entre les cellules de mammifères, on observe des différences, par exemple des différences de glycosylation entre les cellules de rongeurs et les cellules humaines. Même au sein d'une lignée cellulaire, la stabilisation d'une lignée cellulaire entraîne souvent une modification des schémas de glycosylation. Le seul moyen commercialement viable d'utiliser des cellules de mammifères comme systèmes hôtes est d'obtenir un produit final de grande valeur. Les lignées cellulaires de mammifères les plus courantes, en particulier dans la recherche, sont la COS-7 du singe Cercopithecus aethiops, la CHO du hamster Cricetulus griseus et la lignée rénale humaine HEK293[3].

Un système d'expression eucaryote protiste courant est la moisissure visqueuse Dictyostelium discoideum, qui est unique car elle possède un plasmide circulaire, conditionné de manière similaire à la chromatine. En tant qu'organisme eucaryote haploïde simple, il peut se développer à des concentrations élevées sans les conditions coûteuses de la culture de cellules de mammifères, et effectuer des modifications post-traductionnelles. La protéine elle-même est exprimée sous plusieurs formes, notamment sous forme attachée à la membrane, sécrétée ou associée à la cellule, et peut glycosyler le produit protéique[16].

Les champignons sont des décomposeurs naturels de nombreux écosystèmes. Par conséquent, ils sont capables de sécréter de grandes quantités d'enzymes, plus que les systèmes basés sur les bactéries. Cependant, l'utilisation des champignons comme systèmes d'expression s'est heurtée à plusieurs obstacles, notamment en raison du manque de connaissances sur la génétique des champignons, dû à leur complexité inhérente. Les champignons filamenteux ont constitué un système hôte intéressant, notamment Penicillium (d'où provient la pénicilline), Trichoderma reesei et Aspergillus Niger. Les champignons filamenteux produisent efficacement des protéines extracellulaires, évitant ainsi l'étape supplémentaire de la destruction des cellules pour extraire les protéines. Certains ont également des conditions de croissance et de milieu peu coûteuses. Les champignons possèdent également des capacités de glycolysation et de modification qui sont utiles pour les protéines eucaryotes. En outre, ils ont également produit avec succès des protéines liées aux vaccins et certains champignons filamenteux sont jugés GRAS par la FDA. Cependant, l'inconvénient majeur de l'utilisation de ce système hôte est que les rendements sont extrêmement faibles et ne sont pas économiquement viables. De plus, la faible quantité de protéines produites est souvent dégradée par les protéases fongiques. L'utilisation de souches déficientes en protéases constitue une approche pour remédier à ce problème. Les chercheurs tentent également d'appliquer différentes méthodes de perturbation génétique. Grâce à une meilleure compréhension de la régulation et de l'expression des gènes fongiques, nous pouvons nous attendre à ce que les champignons filamenteux deviennent un système hôte éventuellement viable.

Les chercheurs utilisent souvent des techniques d'expression hétérologue pour étudier les interactions entre les protéines. Par exemple, les bactéries sont optimisées dans l'expression hétérologue et la biosynthèse de la nitrogénase grâce à NifEN. Celle-ci peut être exprimée et modifiée dans E.coli[17]. Grâce à cet hôte, il reste extrêmement difficile d'exprimer de manière hétérologue une métalloprotéine complexe et hétéromulmérique comme la NifEN, avec un ensemble complet de sous-unités, de grappes métalliques et de fonctionnalités. La variante de NifEN conçue dans cet hôte bactérien peut conserver son efficacité de cofacteur sur des sites de liaison de cofacteurs analogues, ce qui prouve l'expression hétérologue et encourage les recherches futures sur cette métalloenzyme. En outre, des rapports récents font état de l'utilité de nouveaux systèmes de champignons filamenteux pour la production de protéines industrielles. Parmi les avantages de ces systèmes figurent des fréquences de transformation élevées, la production de protéines à un pH neutre, une faible viscosité du bouillon de fermentation due à la sélection de souches non filamenteuses et des temps de fermentation courts. De nombreux produits génétiques humains, tels que l'albumine, l'IgG et l'interleukine 6, sont exprimés dans des systèmes hétérologues avec plus ou moins de succès[18]. Des résultats incohérents ont laissé entrevoir le passage d'études gène par gène à une approche de la modification post-traductionnelle à l'échelle de l'organisme entier. Les ovocytes sont facilement optimisés pour leur grande taille et leur capacité de traduction, ce qui permet d'observer des réponses cellulaires intégrées. Cela s'applique aux études de molécules uniques dans des cellules uniques et aux applications de criblage de médicaments à moyen débit. En criblant les ovocytes pour l'expression de l'ADNc injecté, l'application de la micro-injection comme modèle d'expression hétérologue peut être étudiée plus avant en termes de signalisation cellulaire, de transport, d'architecture et de fonction des protéines[15].

Les systèmes d'expression hétérologues peuvent être incorporés cliniquement pour évaluer l'activité enzymatique dans des conditions hautement reproductibles pour le développement de médicaments in vitro[19] - [13]. Cela permet de minimiser les risques pour les patients en servant d'alternative aux procédures hautement invasives ou au potentiel de développement de réactions indésirables aux médicaments. L'analyse de l'activité enzymatique nécessite différents systèmes d'expression pour classer les variantes enzymatiques. Contrairement à d'autres animaux, l'expression de protéines recombinantes fonctionnelles est un processus coûteux pour les cellules de mammifères en raison des faibles niveaux d'expression des enzymes contribuant au métabolisme des médicaments. En conséquence, les processus de modification post-traductionnelle diffèrent d'une espèce à l'autre et limitent la précision des comparaisons. Le premier produit protéique hétérologue mis sur le marché est l'insuline humaine, plus communément connue sous le nom d'Humulin. Ce produit est fabriqué à partir d'une souche d'E. coli. La plupart des bactéries, y compris E. coli, sont incapables de sécréter avec succès de telles protéines, ce qui nécessite des étapes supplémentaires de récolte et de désintégration des cellules et d'isolement du produit avant la purification de la protéine.

Comme pour Humulin, l'expression hétérologue est utilisée avec succès pour le développement de médicaments. L'expression hétérologue par clonage de gènes produisant des produits naturels bioactifs d'intérêt peut également être exprimée dans des systèmes hôtes et mise à l'échelle pour la production de médicaments. Par exemple, plusieurs produits naturels d'importance clinique issus de champignons sont difficiles à cultiver en laboratoire. Cependant, après identification des groupes de gènes actifs correspondants, ces gènes peuvent être clonés dans la levure et exprimés également pour produire le produit d'intérêt d'une manière plus rentable et plus rapide. Cette méthode peut également être utilisée pour découvrir de nouveaux médicaments. Cette expérience permet de caractériser et d'exprimer des séquences génétiques fongiques qui ne sont pas étudiées auparavant, ce qui permet de produire de nouveaux produits naturels[20]. Cependant, avec la mutagenèse des gènes vers un composé plus biologiquement pertinent, celui-ci peut ensuite être exprimé pour donner un nouveau produit génétiquement modifié[21].

Une autre utilisation importante de l'expression hétérologue est le criblage de différents médicaments dans un système hôte plutôt que dans un système natif plus coûteux ou difficile à maintenir. Un exemple serait l'utilisation de Mycobacterium marinum comme système hôte alternatif par rapport à l'utilisation directe de Mycobacterium tuberculosis. M. tuberculosis nécessite des installations de niveau de biosécurité élevé pour le dépistage des médicaments et a un taux de croissance lent, ce qui rend le processus coûteux et long. Les chercheurs ont donc testé un M. marinum étroitement apparenté et moins dangereux, qui, par l'expression hétérologue de deux activateurs de médicaments, est devenu un modèle précis pour tester les médicaments antituberculeux[22]. L'expression hétérologue de protéines de canaux ioniques est un exemple de cible médicamenteuse plus ciblée. Elle permet de tester différents médicaments pour les canaux ioniques cardiaques qui modifient leur fonction afin de lutter contre les maladies cardiaques[23]. De même, l'expression hétérologue de récepteurs clonés peut permettre le criblage de médicaments[24]. L'avantage de l'expression hétérologue est qu'elle produit de grandes quantités de récepteurs cibles de médicaments intéressants et qu'elle est généralement inépuisable, reproductible et peu coûteuse. Ces récepteurs pourraient ensuite être utilisés dans des essais visant à tester l'efficacité et la spécificité de la liaison des médicaments. En outre, les récepteurs produits pourraient eux-mêmes être utilisés à des fins thérapeutiques. Ils pourraient servir de leurres pour les toxines ou les molécules de signalisation en excès, et lier/atténuer ces molécules.

La technologie recombinante a également joué un rôle dans le développement des biocarburants. Elle est explorée à l'aide de systèmes d'expression présents dans les bactéries, les plantes et les levures. Plus précisément, l'expression hétérologue d'enzymes cellulases utilise la cellulose, la matière première la plus abondante au monde. Les enzymes cellulolytiques se trouvent dans les plantes, les insectes, les bactéries et les champignons et contribuent à la conversion de la biomasse en biocarburant[25]. Plus précisément, la cellulose est hydrolysée pour former des molécules de sucre. Par exemple, la manipulation des niveaux d'expression cellulaire des enzymes cellulolytiques est nécessaire dans les hôtes fongiques afin de surmonter la dégradation. Cependant, la biotransformation s'est avérée difficile pour former des protéines à haut rendement et nécessite l'incorporation d'autres enzymes. Diverses souches microbiennes peuvent être combinées pour exprimer des enzymes qui se traduisent par une augmentation totale du rendement enzymatique à une échelle économiquement viable[25].

Cette image montre la comparaison du riz ordinaire non modifié à côté du riz doré. Le riz doré présente une expression hétérologue du gène du bêta-carotène.

Le riz doré est un OGM créé en 2005 par expression hétérologue dans le cadre d'un effort humanitaire visant à lutter contre les effets de la carence en vitamine A. Le riz Oryza sativa est transfecté avec un gène pour produire du β-carotène, un précurseur de la vitamine A qui a une couleur jaune-orange[26].