Bactériophage

• phage λ - lysogène
• phage T4 (169 à 170 kilopaires de bases, 200 nm de long)
• phage T5
• phage T7
• phage R17 - Le prototype des phages à ARN. L'un des virus les plus simples connus.
• phage M13 - Phagemid (en)
• phage ϕX174 - phage à ADN simple brin, le premier organisme dont le génome ait été séquencé.

Le phage S-PM2.

Dans les années 1960, les recherches menées sur les interactions hôte/phage par les biologistes américains Max Delbrück, Alfred Hershey et Salvador Luria valurent à ces chercheurs le prix Nobel de médecine-physiologie en 1969.

Les phages ont permis différentes découvertes :

• en 1961, Francis Crick, Sydney Brenner, Leslie Barnett et R.J. Watts-Tobin utilisent différentes souches d'E. coli et du phage T4 pour démontrer que l'ADN porte l'information génétique sous forme de codons de trois nucléotides non-chevauchant (expérience de Crick, Brenner et al.)[13] ;
• l'expérience de Hershey et Chase a permis de confirmer la fonction de l'ADN en tant que support de l'information génétique. Hershey et Chase incorporèrent du phosphore 32 (P32) dans l'ADN d'une culture de phage et du soufre 35 (S35) dans les protéines d'une autre culture de ce même phage[2]. Ces deux isotopes sont radioactifs, ce qui permet de les utiliser comme traceurs. Puis, ils utilisèrent chacune de ces cultures de phage indépendamment pour infecter E. Coli à raison d'un nombre élevé de particules virales par cellule bactérienne. Après un temps suffisant pour que l'infection ait eu lieu, ils détachèrent les enveloppes vides des phages des cellules bactériennes par agitation mécanique. Par centrifugation, ils séparèrent les cellules bactériennes des enveloppes vides et mesurèrent la radioactivité des deux fractions obtenues. En utilisant les phages marqués au P32, la majeure partie de la radioactivité aboutissait dans les cellules bactériennes, indiquant que l'ADN de phage entre dans les cellules. Au contraire, le S35 est retrouvé dans les enveloppes montrant que les protéines du phage n'avaient pas pénétré dans la cellule bactérienne. Conclusion: l'ADN est le matériel héréditaire tandis que les protéines de phages ne sont qu'un emballage qui est écarté une fois que l'ADN a été injecté dans la cellule bactérienne ;
• en 1980, le biochimiste britannique Frederick Sanger reçut le prix Nobel pour avoir réussi à séquencer l'ADN en utilisant un phage. Le premier organisme biologique dont le génome a été séquencé est un phage (utilisé parce que son matériel génétique est encapsidé sous forme d'ADN simple brin). Le protocole de la méthode de séquençage est le suivant : incubation de l'ADN à séquencer avec une amorce, le fragment de Klenow (ADN pol I dépourvue d'activité exonucléasique 5'→3'), les 4 désoxyribonucléotides (dNTP) et 1 didésoxyribonucléotide (ddNTP) en faible concentration. Le ddNTP induit l'arrêt de l'élongation: tous les fragments obtenus se termineront par ce nucléotide. Puisqu'il est utilisé en faible concentration, on va obtenir des fragments de tailles différentes. On refait l'expérience avec les 4 ddNTP. Les fragments sont séparés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide. Un nucléotide radioactif est incorporé afin de permettre la visualisation des fragments par autoradiographie sur film ;
• les premières expériences suggérant un ARN intermédiaire dans la synthèse protéique. Il s'agit de l'expérience de E. Volkin et L. Astrachan en 1957. Il s'agit d'une expérience de pulse chase dans laquelle l'ARNm est marqué de façon spécifique avec de l'uracile radioactif. L'infection par un bactériophage T2 induit une augmentation de la quantité d'ARNm dans la cellule hôte et cet ARNm a un temps de vie très court (car il est très vite dégradé après le marquage). Conclusion: l'ARN joue un rôle intermédiaire entre l'ADN et les protéines ;
• la découverte des enzymes de restriction en 1962 par W. Arber. Protocole de l'expérience : 2 souches bactériennes A et B sont infectées chacune par un phage X puis le lysat de phage est récupéré pour effectuer une nouvelle infection dans les deux souches bactériennes utilisées précédemment. Observation : le lysat de phage X produit sur A peut infecter les 2 souches bactériennes alors que le lysat de phage X issu de B ne peut pas infecter la souche A. Interprétation et conclusion : les phages ont acquis une spécificité d'hôte qui dépend de la souche dans laquelle ils se sont développés et non de leur génotype. Cette restriction d'hôte est due à la méthylation de l'ADN par des enzymes spécifiques permettant de protéger l'ADN viral de la dégradation par des nucléases de la bactérie. Ces nucléases sont des enzymes de restriction qui ne reconnaissent que la forme non méthylée de leur site de coupure. Si l'enzyme nécessaire à cette méthylation n'est présente que dans la souche A, seuls les phages X-A seront méthylés et non dégradés par les nucléases. Ce mécanisme permet à la bactérie de différencier son propre ADN de l'ADN étranger ;
• la recherche en génétique sur la structure des génomes par Benzer. Celui-ci a déterminé la structure fine des gènes grâce à l'étude de recombinaisons entre mutants de bactériophage T4. Les bactériophages présentent deux avantages énormes : la fréquence de recombinaison est élevée, la descendance est quasi illimitée ce qui permettra d'avoir accès à des événements très rares.

L'étude des phages a des implications importantes en médecine et en génétique, en particulier pour la compréhension des infections virales, des anomalies génétiques, de l'embryologie humaine, des causes du cancer et de la résistance des bactéries aux antibiotiques.

Les phages sont utilisés de multiples manières en biologie moléculaire. Ils sont utilisés comme vecteurs de clonage pour insérer de l'ADN dans les bactéries. La méthode du phage display est une méthode qui permet la sélection d'un peptide grâce à sa présentation sur la surface de phages. Le phage display est une technique permettant la construction de banques d'ADN ou d'ADN complémentaire. Les 2 principaux phages utilisés dans cette technique sont les phages M13 (phage filamenteux) et lambda qui infectent tous les deux E. Coli. Prenons l'exemple du phage M13 qui est un phage filamenteux capable d'infecter uniquement les bactéries gram (-) ayant incorporé le facteur F et dont l'infection conduit à la lysogénie. Sa capside contient, entre autres, les protéines P8 et P3 nécessaires pour la liaison du bactériophage à la bactérie via les pilus sexuels. Ces 2 protéines vont être utilisées pour présenter à la surface des phages des molécules d'intérêt (peptide, fragment d'anticorps ou protéine entière): la molécule d'intérêt est fusionnée avec les protéines P8 et P3, par l'insertion du gène codant la molécule d'intérêt à proximité de l'extrémité 5' des gènes P3 et P8 en respectant le cadre de lecture. On utilise l'une ou l'autre des protéines selon le type de molécule et la quantité de molécules à exposer à la surface du phage. On distingue les phages polyvalents/homogènes, où toutes les protéines P3 et P8 sont fusionnées, des phages monovalents/hétérogènes où seulement une partie des protéines le sont. La technique permet d'obtenir des banques d'ADN que l'on peut facilement conserver et les clones sélectionnés sont multipliés à faible coût. Cette technique va permettre de produire des anticorps sans devoir passer par l'immunisation d'un animal. Limite de la technique: certaines molécules ne peuvent pas être exprimées comme les molécules toxiques pour la cellule hôte. Il y a donc une capacité limitée à transformer E. Coli.

Le séquençage d'un génome ne se fait pas d'un seul coup, mais petit à petit sur des fragments de génomes. Pour cela ces fragments d'ADN peuvent être stockés et multipliés dans des organismes servant de banque d'ADN. Les phages en tant que vecteurs de clonage le permettent.

Principalement utilisés dans l'agroalimentaire puis en médecine vétérinaire, les phages sont aussi étudiés en médecine comme alternative à la résistance aux antibiotiques[2]. En Hollande est également commercialisé un cocktail de phages pour lutter contre les contaminations de Listeria dans les produits alimentaires[14].

En 2006, aux États-Unis, une préparation bactériophagique à base de six virus bactériophages a été autorisée comme conservateur alimentaire, notamment pour lutter contre la listériose[15] - [2].

Plus de la moitié des antibiotiques produits sont utilisés dans les élevages[16]. Les préparations à base de phages offrent une intéressante alternative de contrôle et de prévention des infections. En Norvège, des essais cliniques sont menés en aquaculture[17].

Les phages lytiques peuvent être utilisés pour combattre des infection bactériennes, ces phagothérapies ont été imaginées et utilisées dès la découverte de ces virus. On parle alors de traitement bactériophagique. Ils ont été utilisés d'abord en France, en Allemagne, puis en Géorgie indépendante, en URSS, en Pologne, aux Etats-Unis, et finalement partout dans le monde[18] - [19], avec ou sans adjonction de traitement antibiotique.

En France, leur utilisation et commercialisation disparaît au début des années 1980 (on les trouve dans le Vidal jusqu'en 1978 et on les utilise encore pendant des années dans certains centres hospitaliers comme à Montpellier[8]), leur efficacité n'étant pas remise en question mais leur utilisation étant moins pratique que celle des antibiotiques et demeurant assez empirique (pas d'évaluation de la spécificité des phages, pas de titration des solutions...)[20]. De la même façon Eli Lilly cesse la commercialisation des phagiques aux Etats-Unis avec le développement des antibiotiques[21].

Par contre l'emploi des médicaments bactériophagiques s'est maintenu dans les pays du bloc soviétique et on les utilise toujours couramment en Géorgie et en Russie. Les médicaments bactériophagiques sont systématiquement employés en première approche en Russie pour traiter certaines infections telles que la shigellose[22]. La consommation en Russie s'élève à plus de 1 000 000 000 (un milliard) de boîtes de phagiques par an[23].

La phagothérapie fait actuellement l'objet d'un regain d'intérêt car elle présente une solution pour traiter les infections par des souches bactériennes résistantes aux antibiotiques. Les bactériophages constituent une piste sérieuse dans la découverte de traitements durables contre les infections bactériennes[18].

Plusieurs entreprises dans le monde travaillent au développement de solutions bactériophagiques selon des standards occidentaux. En France l'entreprise Pherecydes Pharma développe des « cocktails de phages » pour traiter/prévenir les infections de grandes plaies exposées (brûlure notamment) et les infections pulmonaires[24].

La phagothérapie est désormais possible en France dans le cadre d'une Autorisation Temporaire d'Utilisation nominative, c'est-à-dire au cas par cas, et dans les limites prévues par l'ANSM[25] :

• un pronostic vital engagé ou pronostic fonctionnel menacé ;
• l’impasse thérapeutique ;
• une infection mono-microbienne.

S'y ajoutent les restrictions suivantes :

• la nécessité d’un groupe de validation issu du Comité Scientifique Spécialisé Temporaire Phagothérapie de l'ANSM pour toute demande d’ATUn de bactériophages afin d’obtenir un avis collégial ;
• la nécessité de disposer des résultats d’un phagogramme avant la décision d’une mise sous traitement.

Devant les difficultés à se soigner avec les bactériophages dans le cadre légal, des organisations de patients se sont montées en France pour faciliter l'accès à la phagothérapie tant en France qu'à l'étranger[26] - [6] - [27].

Phages.fr : Réseau scientifique français d'envergure nationale dont le but est de promouvoir, coordonner et intégrer les études des interactions bactériophages-bactéries à travers différentes disciplines scientifiques, tout en favorisant l’établissement de collaborations et synergies entre laboratoires[28].

AVIBEP : L'Association des Victimes de l’Interdiction des Bactériophagiques Etrangers et de leurs Proches, a pour but d’aider les malades à avoir accès aux phagiques français et étrangers afin que plus un malade ne se voie condamné à mourir ou à être amputé sans avoir été traité auparavant par phagothérapie lorsque cela est possible, y compris avec des bactériophagiques étrangers si nécessaire. L'association demande que d'une part les médicaments agréés à l'étranger soient autorisés automatiquement en France dans le cadre de la réglementation compassionnelle existante, et que d'autre part soit de nouveau mis en place un centre de fabrication de bactériophages à la demande, analogue à ce qu'ont fait les Instituts Pasteur de Paris, Lyon et Strasbourg durant une cinquantaine d'années pour les médecins de ville et les hôpitaux. Elle s'appuie sur l'Etude Burden BMR[29] pour affirmer que chaque année environ 10 000 vies sont perdues qui pourraient être sauvées par les bactériophagiques étrangers[6].

Le Lien : Association de défense des patients et des usagers de la santé. Son cœur de mission est de défendre les victimes d’infections nosocomiales et d'accidents médicaux, qu’il s’agisse d’erreurs, de fautes ou d’aléas. Elle milite pour la réintroduction des bactériophagiques en France[30].

Phag Espoirs : Vise à promouvoir d’une part la recherche et l’utilisation des bactériophages dans le domaine diagnostique et thérapeutique, et d’autre part à soutenir les patients désirant en savoir plus sur les bactériophages. L'association est principalement composée de médecins[31].

Phages sans frontières : Récolte de fonds et conseils pour aider les patients à aller se faire soigner en Géorgie[27].

PHELIX France : en lien avec l'Université de Leicester au Royaume Uni, porte un projet de détection des infections chroniques par Borrelia (maladie de Lyme) en utilisant des virus bactériophages[32] - [33].

• Bactériophagique
• Félix d'Hérelle
• Phagothérapie
• Phagespoirs
• Phagothérapie (dimensions politiques)
• préparation bactériophagique
• Virophage

• « Bactériophage, à table ! », La Méthode scientifique, France Culture, 15 novembre 2021.
• Collection de phages au Centre de référence pour virus bactériens Félix d'Hérelle de l'Université Laval, Québec.
• EuroPhages - Phagothérapie en France: Se traiter avec des bactériophagiques
• COMPAS - vulgarisation scientifique Les bactéries pathogènes : épidémiologie et thérapie par les bactériophages, Christine Pourcel, Institut de Génétique et Microbiologie d’Orsay, 12 avril 2012
• Phages sans frontieres

• Alain Dublanchet, Des virus pour combattre les infections, éditions Favre, 2009.