Banque génomique

Après qu'une banque génomique ait été construite avec un vecteur viral, tel qu'un phage lambda, le titre de la banque peut être déterminé. Le calcul du titre permet aux chercheurs d'estimer le nombre de particules virales infectieuses qui ont été créées avec succès dans la banque. Pour ce faire, des dilutions de la banque sont utilisées pour transformer des cultures d'E. coli de concentrations connues. Les cultures sont ensuite étalées sur des plaques d'agar et incubées pendant une nuit. Le nombre de plaques virales est compté et peut être utilisé pour calculer le nombre total de particules virales infectieuses dans la banque. La plupart des vecteurs viraux portent également un marqueur qui permet de distinguer les clones contenant un insert de ceux qui n'ont pas d'insert. Cela permet aux chercheurs de déterminer également le pourcentage de particules virales infectieuses portant réellement un fragment de la banque[11]. Une méthode similaire peut être utilisée pour titrer les banques génomiques faites avec des vecteurs non viraux, tels que les plasmides et les BAC. Un test de ligature de la banque peut être utilisé pour transformer E. coli. La transformation est ensuite étalée sur des plaques de gélose et incubée pendant une nuit. Le titre de la transformation est déterminé en comptant le nombre de colonies présentes sur les plaques. Ces vecteurs ont généralement un marqueur sélectionnable permettant la différenciation des clones contenant un insert de ceux qui n'en contiennent pas. En faisant ce test, les chercheurs peuvent également déterminer l'efficacité de la ligature et effectuer les ajustements nécessaires pour s'assurer qu'ils obtiennent le nombre souhaité de clones pour la banque[12].

Hybridation par transfert de colonies

Afin d'isoler des clones qui contiennent des régions d'intérêt d'une banque, celle-ci doit d'abord être filtrée. Une méthode de criblage est l'hybridation, dans laquelle chaque cellule hôte transformée d'une banque ne contiendra qu'un seul vecteur avec un insert d'ADN. Toute la banque peut être plaquée sur un filtre sur support. Le filtre et les colonies sont préparés pour l'hybridation puis marqués avec une sonde[13]. L'ADN-cible (l'insert d'intérêt) peut être identifié par détection, par exemple en autoradiographie, en raison de l'hybridation avec la sonde comme indiqué ci-dessous. Une autre méthode de criblage est la réaction en chaîne par polymérase (PCR). Certaines banques sont stockées sous forme de « pools » de clones et le criblage par PCR est un moyen efficace d'identifier les pools contenant des clones spécifiques[2].

Un plasmide est une molécule d'ADN circulaire double brin couramment utilisée pour le clonage moléculaire. Les plasmides ont généralement une longueur de 2 à 4 kb et sont capables de porter des inserts jusqu'à 15 kb. Les plasmides contiennent une origine de réplication leur permettant de se répliquer à l'intérieur d'une bactérie indépendamment du chromosome hôte. Les plasmides portent généralement un gène de résistance aux antibiotiques qui permet la sélection de cellules bactériennes contenant le plasmide. De nombreux plasmides portent également un gène rapporteur qui permet aux chercheurs de distinguer les clones contenant un insert de ceux qui n'en contiennent pas[3].

Le phage λ est un virus à ADN double brin qui infecte E. coli. Le chromosome λ mesure 48,5 kb de long et peut porter des inserts jusqu'à 25 kb. Ces inserts remplacent les séquences virales non essentielles du chromosome λ, tandis que les gènes nécessaires à la formation de particules virales et à l'infection restent intacts. L'ADN inséré est répliqué avec l'ADN viral ; ainsi, ensemble, ils sont encapsidés en particules virales. Ces particules sont très efficaces pour l'infection et la multiplication, conduisant ainsi à une production plus élevée de chromosomes λ recombinants[3]. Cependant, en raison de la taille plus petite de l'insert, les banques faites avec le phage λ peuvent nécessiter de nombreux clones pour une couverture complète du génome[14].

Les cosmides sont des plasmides qui contiennent une petite région d'ADN du bactériophage λ appelée séquence cos. Cette séquence permet au cosmide d'être conditionné en particules de bactériophage λ. Ces particules, contenant un cosmide linéarisé, sont introduites dans la cellule hôte par transduction. Une fois à l'intérieur de l'hôte, les cosmides circulent à l'aide de l'ADN ligase de l'hôte, puis fonctionnent comme des plasmides. Les cosmides sont capables de transporter des inserts jusqu'à 40 kb[2].

Les vecteurs du bactériophage P1 peuvent contenir des inserts de 70 à 100 kb. Ce sont au départ des molécules d'ADN linéaires encapsidées dans des particules de bactériophage P1. Ces particules sont injectées dans une souche d'E. coli exprimant la recombinase CRE. Le vecteur P1 linéaire devient alors circularisé par recombinaison entre deux sites loxP dans le vecteur. Les vecteurs P1 contiennent généralement un gène de résistance aux antibiotiques et un marqueur de sélection positive pour distinguer les clones contenant un insert de ceux qui n'en contiennent pas. Les vecteurs P1 contiennent également un réplicon de plasmide P1, qui garantit qu'une seule copie du vecteur est présente dans une cellule. Cependant, il existe un deuxième réplicon P1 - appelé réplicon lytique P1 - qui est contrôlé par un promoteur inductible. Ce promoteur permet l'amplification de plus d'une copie du vecteur par cellule avant l'extraction de l'ADN[2].

Vecteur BAC

Les chromosomes artificiels P1 (PAC) possèdent des caractéristiques à la fois des vecteurs P1 et des chromosomes artificiels bactériens (BAC). Semblables aux vecteurs P1, ils contiennent un plasmide et un réplicon lytique comme décrit ci-dessus. Mais contrairement aux vecteurs P1, ils n'ont pas besoin d'être encapsidés dans des particules de bactériophage pour la transduction. Au lieu de cela, ils sont introduits dans E. coli sous forme de molécules d'ADN circulaires par électroporation, tout comme les BAC[2]. Également similaires aux BAC, ils sont relativement plus difficiles à préparer en raison du fait qu'ils n'ont qu'une seule origine de réplication[15].

Les chromosomes artificiels bactériens (BAC) sont des molécules d'ADN circulaires, généralement d'environ 7 kb de longueur, qui sont capables de contenir des inserts jusqu'à 300 kb. Les vecteurs BAC contiennent un réplicon dérivé du facteur F dE. coli, ce qui garantit qu'ils sont maintenus à une copie par cellule[4]. Une fois qu'un insert est ligaturé dans un BAC, celui-ci est introduit dans des souches déficientes en recombinaison dE. coli par électroporation. La plupart des vecteurs BAC contiennent un gène de résistance aux antibiotiques et également un marqueur de sélection positive[2]. La figure de droite représente un vecteur BAC coupé avec une enzyme de restriction, suivi de l'insertion d'un ADN étranger qui est réannexé par une ligase. Dans l'ensemble, il s'agit d'un vecteur très stable, mais certains peuvent être difficiles à préparer en raison de la présence d'une seule origine de réplication, tout comme les PAC[15].

Les chromosomes artificiels de levure (YAC) sont des molécules d'ADN linéaires contenant les caractéristiques nécessaires à un chromosome de levure authentique, y compris des télomères, un centromère et une origine de réplication. De grands inserts d'ADN peuvent être ligaturés au milieu du YAC de sorte qu'il y ait un « bras » du YAC de chaque côté de l'insert. Le YAC recombinant est introduit dans la levure par transformation ; les marqueurs sélectionnables présents dans le YAC permettent d'identifier les transformants réussis. Les YAC peuvent contenir des insertions jusqu'à 2000 kb, mais la plupart des banques YAC contiennent des inserts de 250 à 400 kb. Théoriquement, il n'y a pas de limite supérieure sur la taille de l'insert qu'un YAC peut contenir. C'est la qualité de la préparation de l'ADN utilisé pour les inserts qui détermine la taille limite[2]. L'aspect le plus problématique à l'utilisation de YAC est le fait qu'ils sont potentiellement sujets à des réarrangements[15].

La formule ci-dessus peut être utilisée pour déterminer le niveau de confiance à 99% certifiant que toutes les séquences d'un génome sont représentées en utilisant un vecteur avec une taille d'insert de 20 000 paires de bases (comme le vecteur phage lambda). La taille du génome de l'organisme est de 3000 Mb dans cet exemple.

${\displaystyle N={\frac {ln(1-0.99)}{ln[1-{\frac {2.0\times 10^{4}pb}{3.0\times 10^{9}pb}}]}}}$

${\displaystyle N={\frac {-4.61}{-6.7\times 10^{-6}}}}$

${\displaystyle N=688060}$ clones 

Ainsi, environ 688 060 clones sont nécessaires pour garantir une probabilité de 99% qu'une séquence d'ADN donnée de ce génome de trois milliards de paires de bases soit présente dans une banque utilisant un vecteur avec une taille d'insert de vingt mille paires de bases.

Séquençage "shotgun" du génome entier versus séquençage "shotgun" hiérarchique

Une utilisation majeure des banques génomiques est le séquençage "shotgun" hiérarchique, également appelé séquençage top-down, basé sur un séquençage par cartographie ou clone par clone. Cette stratégie a été développée dans les années 1980 pour le séquençage de génomes entiers avant que des techniques de séquençage à haut débit ne soient disponibles. Les clones individuels des banques génomiques peuvent être cisaillés en fragments plus petits, généralement de 500 pb à 1000 pb, qui sont plus faciles à gérer pour le séquençage[4]. Une fois qu'un clone d'une banque génomique est séquencé, la séquence peut être utilisée pour cribler la banque pour d'autres clones contenant des inserts qui chevauchent le clone séquencé. Tout nouveau clone se chevauchant peut ensuite être séquencé pour former un contig. Cette technique, appelée arpentage chromosomique, peut être exploitée pour séquencer des chromosomes entiers[2]. Le séquençage "shotgun" du génome entier est une autre méthode de séquençage du génome qui ne nécessite pas de banque de vecteurs de grande capacité. Au lieu de cela, il utilise des algorithmes informatiques pour assembler des lectures de séquences courtes pour couvrir l'ensemble du génome. Les banques génomiques sont souvent utilisées en combinaison avec le séquençage "shotgun" du génome entier pour cette raison. Une cartographie haute résolution peut être créée en séquençant les deux extrémités des inserts de plusieurs clones dans une banque génomique. Cette carte fournit des séquences de distances connues, qui peuvent être utilisées pour faciliter l'assemblage des lectures de séquence acquises par le séquençage "shotgun"[4]. La séquence du génome humain, qui a été déclarée complète en 2003, a été assemblée à l'aide d'une banque BAC et d'un séquençage "shotgun"[19] - [20].

Les études d'association pangénomiques sont des applications générales pour trouver des cibles génétiques spécifiques et des polymorphismes au sein de l'humanité. En fait, le projet International HapMap a été créé grâce à un partenariat de scientifiques et d'agences de plusieurs pays pour cataloguer et utiliser ces données[21]. Le but de ce projet est de comparer les séquences génétiques de différents individus pour élucider les similitudes et les différences au sein des régions chromosomiques. Les scientifiques de tous les pays participants répertorient ces attributs avec des données provenant de populations d'ascendance africaine, asiatique et européenne. De telles évaluations à l'échelle du génome peuvent conduire à d'autres thérapies diagnostiques et médicamenteuses tout en aidant les futures équipes à se concentrer sur l'organisation des thérapies en tenant compte des caractéristiques génétiques. Ces concepts sont déjà exploités en génie génétique. Par exemple, une équipe de recherche a construit un vecteur navette PAC qui crée une banque représentant une couverture double du génome humain[18]. Cela pourrait servir de ressource inédite pour identifier des gènes ou des ensembles de gènes à l'origine de maladies. De plus, ces études peuvent servir de moyen performant pour étudier la régulation transcriptionnelle comme cela a été vu dans l'étude des baculovirus[22]. Dans l'ensemble, les progrès dans la construction de banques de génomes et le séquençage d'ADN ont permis une découverte efficace de différentes cibles moléculaires[5]. L'assimilation de ces caractéristiques par des méthodes aussi efficaces peut accélérer l'emploi de nouveaux médicaments-candidats.

• (en) Cet article est partiellement ou en totalité issu de l’article de Wikipédia en anglais intitulé « Genomic library » (voir la liste des auteurs).

Klug, Cummings, Spencer, Palladino, Essentials of Genetics, Pearson, 2010, 355–264 p. (ISBN 978-0-321-61869-6)

• (en) Construction d'une banque BAC