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Amplicon

En biologie moléculaire, un amplicon est un morceau d'ADN ou d'ARN qui est la source et/ou le produit d'événements d'amplification ou de réplication. Il peut être formé artificiellement, en utilisant diverses méthodes, notamment les réactions en chaîne par polymérase (PCR) ou les réactions en chaîne par ligase (LCR), ou naturellement par duplication de gènes. Dans ce contexte, l'amplification fait référence à la production d'une ou plusieurs copies d'un fragment génétique ou d'une séquence cible, en particulier l'amplicon. Comme il fait référence au produit d'une réaction d'amplification, l'amplicon est utilisé de manière interchangeable avec des termes de laboratoire courants, tels que « produit de PCR ».

Un modèle de séquence d'amplicon qui a été préparé pour l'amplification. La séquence cible à amplifier est colorée en vert.

L'amplification artificielle est utilisée dans la recherche[1], la médecine légale[2], et la médecine [1] à des fins qui incluent la détection et la quantification des agents infectieux[3], l'identification des restes humains[4], et l'extraction des génotypes des cheveux humains[2].

La duplication naturelle des gènes joue un rôle majeur dans l'évolution. Il est également impliqué dans plusieurs formes de cancer humain, notamment le lymphome médiastinal primitif à cellules B et le lymphome de Hodgkin[5]. Dans ce contexte, le terme amplicon peut désigner à la fois une section d'ADN chromosomique qui a été excisée, amplifiée et réinsérée ailleurs dans le génome, et un fragment d'ADN extrachromosomique appelé double minute, chacun pouvant être composé d'un ou plusieurs gènes. L'amplification des gènes codés par ces amplicons augmente généralement la transcription de ces gènes et finalement le volume des protéines associées[6].

Structure

Les amplicons sont en général des séquences génétiques répétées directes (tête-à-queue) ou répétées inversées (tête-à-tête ou queue-à-queue), et peuvent être de structure linéaire ou circulaire[7]. Les amplicons circulaires consistent en des duplications inversées imparfaites recuites dans un cercle[8] et on pense qu'ils proviennent d'amplicons linéaires précurseurs[9].

Lors de l'amplification artificielle, la longueur de l'amplicon est dictée par les objectifs expérimentaux[10].

Technologie

L'analyse des amplicons a été rendue possible par le développement de méthodes d'amplification telles que la PCR, et de plus en plus par des technologies moins chères et à plus haut débit pour le séquençage de l'ADN ou le séquençage de nouvelle génération, comme le séquençage des semi-conducteurs ioniques, communément appelé la marque du développeur, Ion Torrent[11].

Les technologies de séquençage de l'ADN telles que le séquençage de nouvelle génération ont permis d'étudier les amplicons dans la biologie et la génétique du génome, y compris la recherche sur la génétique du cancer[12], la recherche phylogénétique et la génétique humaine[13]. Par exemple, en utilisant le gène de l'ARNr 16S, qui fait partie de chaque génome bactérien et archéen et est hautement conservé, les bactéries peuvent être classées taxonomiquement en comparant la séquence d'amplicon à des séquences connues. Cela fonctionne de manière similaire dans le domaine fongique avec le gène de l'ARNr 18S ainsi que la région non codante ITS1[14].

Indépendamment de l'approche utilisée pour amplifier les amplicons, une technique doit être utilisée pour quantifier le produit amplifié[15]. Généralement, ces techniques intègrent une étape de capture et une étape de détection, bien que la façon dont ces étapes sont incorporées dépend de l'essai individuel.

Les exemples incluent le Amplicor HIV-1 Monitor Assay (RT-PCR), qui a la capacité de reconnaître le VIH dans le plasma ; le QT du VIH-1 (NASBA), qui est utilisé pour mesurer la charge virale plasmatique en amplifiant un segment de l'ARN du VIH ; et l'amplification médiée par la transcription, qui utilise un test de protection par hybridation pour distinguer les infections à Chlamydia trachomatis[15]. Différentes étapes de détection et de capture sont impliquées dans chaque approche pour évaluer le produit d'amplification, ou amplicon. Avec le séquençage des amplicons, le grand nombre d'amplicons différents résultant de l'amplification d'un échantillon habituel sont concaténés et séquencés. Après contrôle de la qualité, la classification est effectuée par différentes méthodes, les comptages de taxons identiques représentant leur abondance relative dans l'échantillon.

Applications

La PCR peut être utilisée pour déterminer le sexe à partir d'un échantillon d'ADN humain[16]. Le lieu d'insertion de l'élément Alu est sélectionné, amplifié et évalué en termes de taille du fragment. Le test de sexe utilise AluSTXa pour le chromosome X, AluSTYa pour le chromosome Y, ou à la fois AluSTXa et AluSTYa, pour réduire la possibilité d'erreur à une quantité négligeable. Le chromosome inséré donne un gros fragment lorsque la région homologue est amplifiée. Les mâles se distinguent par la présence de deux amplicons d'ADN, tandis que les femelles n'ont qu'un seul amplicon. Le kit adapté pour la mise en oeuvre du procédé comprend un couple d'amorces pour amplifier le locus et éventuellement des réactifs de réaction en chaîne par polymérase[17].

La LCR peut être utilisée pour diagnostiquer la tuberculose[18]. La séquence contenant l'antigène protéique B est ciblée par quatre amorces oligonucléotidiques - deux pour le brin sens et deux pour le brin antisens. Les amorces se lient adjacentes les unes aux autres, formant un segment d'ADN double brin qui, une fois séparé, peut servir de cible pour de futurs cycles de réplication. Dans ce cas, le produit peut être détecté via le dosage immunoenzymatique des microparticules (MEIA).

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Notes et références

Références
  1. Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, New York, NY, VCH Publishers, , 53, 585 (ISBN 1-56081-925-1, lire en ligne)
  2. Walsh, Metzger et Higuchi, « Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material », BioTechniques, vol. 10, no 4,‎ , p. 506–13 (PMID 1867860)
  3. Consumer Affairs Branch, « Roche Amplicor HIV-1 Monitor Test », FDA, (consulté le )
  4. Gill, Ivanov, Kimpton et Piercy, « Identification of the remains of the Romanov family by DNA analysis », Nature Genetics, vol. 6, no 2,‎ , p. 130–5 (PMID 8162066, DOI 10.1038/ng0294-130, S2CID 33557869)
  5. Rui, Emre, Kruhlak et Chung, « Cooperative Epigenetic Modulation by Cancer Amplicon Genes », Cancer Cell, vol. 18, no 6,‎ , p. 590–605 (PMID 21156283, PMCID 3049192, DOI 10.1016/j.ccr.2010.11.013)
  6. Bignell, Santarius, Pole et Butler, « Architectures of somatic genomic rearrangement in human cancer amplicons at sequence-level resolution », Genome Research, vol. 17, no 9,‎ , p. 1296–303 (PMID 17675364, PMCID 1950898, DOI 10.1101/gr.6522707)
  7. Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology, Academic Press, , 280–287 (ISBN 978-0-12-540054-1, lire en ligne Accès limité)
  8. Grodin, Roy et Ouellette, « Formation of extrachromosomal circular amplicons with direct or inverted duplications in drug-resistant Leishmania tarentolae. », Mol. Cell. Biol., vol. 16, no 7,‎ , p. 3587–3595 (PMID 8668175, PMCID 231354, DOI 10.1128/mcb.16.7.3587)
  9. Grodin, Küding, Roy et Ouellette, « Linear amplicons as precursors of amplified circles in methotrexate-resistant Leishmania tarentolae. », Nucleic Acids Res., vol. 26, no 14,‎ , p. 3372–3378 (PMID 9649621, PMCID 147699, DOI 10.1093/nar/26.14.3372)
  10. PCR Primer Design Guidelines. Premier Biosoft: Accelerating Research in Life Sciences. Retrieved from: http://www.premierbiosoft.com/tech_notes/PCR_Primer_Design.html
  11. « Ion Torrent Official Webpage » [archive du ] (consulté le )
  12. International Cancer Genome Consortium Official Website
  13. National Human Genome Research Institute
  14. Usyk, Zolnik, Patel et Levi, « Novel ITS1 Fungal Primers for Characterization of the Mycobiome », mSphere, vol. 2, no 6,‎ , e00488–17, /msphere/2/6/mSphere0488–17.atom (ISSN 2379-5042, PMID 29242834, PMCID 5729218, DOI 10.1128/mSphere.00488-17)
  15. Stanley, J. (2002). Essentials of Immunology & Serology by Jacqueline Stanley. Albany, NY: Delmar.
  16. Mannucci, Sullivan, Ivanov et Gill, « Forensic application of a rapid and quantitative DNA sex test by amplification of the X-Y homologous gene amelogenin », International Journal of Legal Medicine, vol. 106, no 4,‎ , p. 190–3 (PMID 8038111, DOI 10.1007/BF01371335, S2CID 3969808)
  17. Hedges, Walker, Callinan et Shewale, « Mobile element-based assay for human gender determination », Analytical Biochemistry, vol. 312, no 1,‎ , p. 77–9 (PMID 12479838, DOI 10.1016/S0003-2697(02)00430-X, S2CID 42177642, lire en ligne)
  18. O'Connor, « The ligase chain reaction as a primary screening tool for the detection of culture positive tuberculosis », Thorax, vol. 55, no 11,‎ , p. 955–957 (PMID 11050266, PMCID 1745641, DOI 10.1136/thorax.55.11.955)

Bibliographie
  • Gregor W. Leckie et Helen H. Lee, Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, New York, Wiley, , 463–6 p. (ISBN 978-0-471-18634-2), « Infectious Disease Testing by Ligase Chain Reaction »
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