High Resolution Melt

Comme un sujet possède deux copies de chaque gène, il y a trois possibilités :

1. Aucun allèle ne contient la mutation (Type sauvage)
2. L'un ou l'autre des allèles contient la mutation (Hétérozygote)
3. Les deux allèles contiennent la mutation (Homozygote)

Les deux allèles étant amplifiés simultanément, la courbe de fluorescence que l'on observe correspond à la somme des courbes de fluorescences des deux allèles. Si la résolution est suffisante, il est possible de les distinguer :

Les SNP (single nucleotide polymorphism) sont des mutations n'affectant qu'un nucléotide. Il est possible de les détecter par HRM, ce qui est bien moins coûteux que l'utilisation d'une puce à ADN. Par exemple, la substitution d'une guanine par une adénine sur le gène Vssc (Voltage sensitive sodium channel) confère une résistance à la permethrine, un acaricide, chez l'acarien Scabies (responsable de la gale). Ce SNP entraîne une température de fusion légèrement plus basse pour l'ADN des acariens résistants. Cela est dû au fait que la liaison G-C est plus forte que la liaison A-T, en raison du nombre de liaisons hydrogène impliquées[2].

En diagnostic clinique, la HRM est parfois préférée ou associée au séquençage pour identifier des mutations[3] - [4] (par exemple, plus de 400 mutations ont été identifiées sur les gènes BRCA1 et BRCA2, impliqués dans le cancer du sein). Actuellement, la HRM est employée principalement comme outil de screening, et selon le besoin complétée par un séquençage.

Le test de zygosité permet de savoir si deux personnes sont de « vrais » jumeaux ou des jumeaux fraternels. Parmi les nombreuses méthodes utilisables, l'HRM peut être envisagée.

La méthodologie HRM a aussi été utilisée pour analyser le statut de méthylation de l'ADN. Cela a une importance particulière en oncogénétique car la méthylation de l'ADN peut diminuer l'expression des gènes régulateurs des tumeurs, comme ceux qui régulent l'apoptose et la réparation de l'ADN. Elle a aussi une influence sur la réponse aux chimiothérapies. Par exemple, si le promoteur du gène de réparation MGMT (O-6-méthylguanine-DNA méthyltransférase) est méthylé, la tumeur sera moins sensible aux agents alkylants. Lors d'une étude[5] conduite par HRM, sur 19 cancers colorectaux analysés, 8 présentaient une méthylation du promoteur MGMT.

Pour obtenir ce résultat, l'échantillon d'ADN est traité par le bisulfite, qui a la propriété de transformer les cytosines non-méthylées (et uniquement celles-là) en uracile. Ainsi, la séquence de bases est modifiée, ce qui affecte la courbe de fusion et peut être détecté lors de l'analyse HRM. La HRM permet de connaître la proportion de méthylation dans un échantillon donné, en comparant la courbe de fusion à une gamme progressive réalisée à partir de mélanges d'ADN non-méthylé et d'ADN entièrement méthylés.