Transfert d'énergie entre molécules fluorescentes

D’après la théorie de Theodor Förster, le FRET est défini comme un transfert d’énergie non radiatif (sans émission de lumière) résultant d’une interaction dipôle – dipôle entre deux molécules (donneur et accepteur d’énergie)[3]. Ce phénomène physique nécessite une compatibilité énergétique entre ces molécules. Cela signifie que le spectre d’émission du donneur doit recouvrir, au moins partiellement, le spectre d’absorption de l’accepteur (Figure 1.A). Ce recouvrement des spectres est défini par une intégrale appelée intégrale de recouvrement J(λ) :

${\displaystyle J=\int f_{\rm {D}}(\lambda )\,\epsilon _{\rm {A}}(\lambda )\,\lambda ^{4}\,d\lambda }$

où ${\displaystyle f_{\rm {D}}}$ est l’intensité de la fluorescence émise par le donneur à une longueur d’onde donnée et ${\displaystyle \epsilon _{\rm {A}}}$ le coefficient d’extinction molaire de l’accepteur. Le facteur J reflète donc la capacité d’une paire de fluorophores à émettre et absorber de l’énergie à la même longueur d’onde.

En accord avec la théorie de Förster, le FRET est un processus qui dépend de la distance séparant les deux molécules, donneur et accepteur, comme le montre la formule suivante :

${\displaystyle E={\frac {1}{1+(R/R_{0})^{6}}}\!}$

où R est la distance effective qui sépare les deux molécules et ${\displaystyle R_{0}}$ le rayon de Förster. Ce dernier correspond à la distance donneur - accepteur pour laquelle l’efficacité du transfert d’énergie est de 50 % (Figure 1.B). Cela signifie que lorsque la distance donneur-accepteur est égale au rayon de Förster, la probabilité pour que le donneur se désexcite par transfert d’énergie non radiatif sur l’accepteur est de 50 %. Cette probabilité de désexcitation augmente en faveur du transfert d’énergie lorsque la distance entre les fluorophores donneur et accepteur diminue. Les autres voies de désexcitation correspondent aux voies radiatives (fluorescence) et non radiatives (extinction par l’oxygène, quenching etc.). Le rayon de Förster dépend de la nature des fluorophores utilisés, et est généralement compris entre 1 et 10 nm[4]. Au-delà de cette gamme, l’efficacité du transfert d’énergie chute très rapidement. L’expression mathématique pour le calcul de cette distance s’écrit :

${\displaystyle {R_{0}}=(10^{-3}\;\kappa ^{2}\,n^{-4}\,Q_{D}\,J)^{1/6}\times 9730}$

où J est l’intégrale de recouvrement, n l’indice de réfraction du milieu (${\displaystyle n^{-4}}$ est généralement compris entre 1/3 et 1/5), ${\displaystyle Q_{D}}$ le rendement quantique du donneur en absence d’accepteur et ${\displaystyle \kappa ^{2}}$ le facteur d’orientation qui est fonction de l’orientation relative des dipôles du donneur et de l’accepteur (Figure 1.C). Même si la valeur de ${\displaystyle \kappa ^{2}}$ est théoriquement comprise entre 0 et 4, 2/3 est la valeur habituellement utilisée pour déterminer le R₀. En effet, ${\displaystyle \kappa ^{2}}$ est assimilé à 2/3 lorsque le donneur et l’accepteur présentent un degré de liberté suffisant pour être aléatoirement orientés dans l’espace[3]. Cette condition est généralement satisfaite pour les fluorophores attachés à des biomolécules car ils peuvent avoir une certaine liberté de rotation[5].

Une molécule capable d’émettre un signal de fluorescence est qualifiée de fluorophore. Différentes caractéristiques photophysiques permettent de le définir :

• les spectres d’excitation et d’émission. Ils représentent la signature de la structure énergétique du fluorophore. La différence de longueur d’onde séparant leur maximum s’appelle le déplacement de Stokes ;
• le coefficient d’extinction molaire (ε). Il correspond à la capacité d’absorption par le fluorophore de l’énergie apportée par un photon à une longueur d’onde donnée ;
• le rendement quantique (Φ). Il caractérise la capacité du fluorophore à re-émettre sous forme de lumière, l’énergie absorbée. Il est défini comme étant le rapport du nombre de photons émis sur le nombre de photons absorbés ;
• la durée de vie de fluorescence (τ). Elle représente le temps de séjour moyen du fluorophore dans son état excité.

Le FRET mesure des intensités. Expérimentalement, ce signal peut être mesuré à l’aide d’un fluorimètre ou en microscopie. Dans un fluorimètre, le signal de FRET mesuré provient d'une population cellulaire disposée dans des puits de taille différente selon les microplaques utilisées. En revanche, les techniques microscopiques mesurent des évènements de transfert d’énergie à l’échelle subcellulaire. Quel que soit le type de détection choisi, la mesure d’un FRET entre deux fluorophores peut être effectuée de différentes manières.

La première consiste à quantifier les variations de l’intensité de fluorescence en mesurant la diminution de la fluorescence du donneur[6], l’augmentation de celle de l’accepteur [7] ou en calculant un rapport que nous appellerons ratio (fluorescence d’émission de l’accepteur/fluorescence d’émission du donneur)[8]. Cette analyse est réalisable aussi bien en microplaque qu’en microscopie. La principale difficulté d’analyse de ces signaux vient du recouvrement pouvant exister entre les spectres d’excitation et d’émission des fluorophores utilisés. Ce manque de sélectivité spectrale est à l’origine d’un important bruit de fond avec comme conséquence une réduction de la sensibilité du test. Des couples de fluorophores tels que la fluorescéine/rhodamine ou les protéines CFP (Cyan fluorescent protein) / YFP (Yellow fluorescent protein) présentent ce type de limitation[9]. Cependant, le signal sur bruit du FRET peut être amélioré en s’affranchissant d’une partie des signaux parasites grâce à une lecture en temps résolu. Ceci est possible en TR-FRET (Time-Resolved Förster Resonance Energy Transfer) grâce à l’utilisation de fluorophores à durée de vie longue tels que les chélates ou cryptates de terre rare (europium, terbium). À ce jour, le TR-FRET est appliqué uniquement dans des formats microplaques.

D'autres méthodes permettent de déterminer indirectement l’existence d’un FRET par photoblanchiment (pbFRET). Le photoblanchiment est une méthode qui consiste à éteindre un fluorophore par une exposition prolongée à une source lumineuse. La mise en œuvre de cette approche est préférable en microscopie confocale car il est ainsi possible d’obtenir une bonne résolution spatiale pour éteindre directement les fluorophores dans leur environnement cellulaire.

Dans le cas du FRET par photoblanchiment (pbFRET), le photoblanchiment du fluorophore donneur entraîne une diminution de son intensité de fluorescence qui est mesurée en présence ou non d’accepteur. Lorsque l’accepteur est en étroite proximité avec le donneur, un FRET apparaît et entre en compétition avec le processus de photoblanchiment. Cette compétition se traduit par une augmentation de la résistance du donneur au photoblanchiment dont les constantes de temps mesurées (en présence ou non d’accepteur) permettent de mettre en évidence un transfert d’énergie [10].

Une autre méthode par rapport au pbFRET du donneur est le pbFRET de l’accepteur aussi appelé DFRAP pour donor fluorescence recovery after acceptor photobleaching. Les émissions de fluorescence du donneur et de l’accepteur sont mesurées avant et après photoblanchiment de l’accepteur. L’augmentation de la fluorescence du donneur après destruction de l’accepteur est argument pour prouver l’existence d’un FRET entre les deux molécules[11] - [12]. L’exemple de la figure 2 illustre ce principe. Dans cette expérience une protéine de fusion formée de deux protéines auto-marquantes, SNAP-tag et CLIP-tag (self-labeling protein tag), est exprimée à la surface de cellules HEK293T via un ancrage par une hélice alpha transmembranaire (Figure 2A).

Figure 2. Retour de fluorescence du donneur d'énergie par photoblanchiment de l'accepteur :
A. Principe.
B. Spectres d'émission et d'absorption du donneur (AlexaFluor 488) et de l'accepteur (Cyanine 5).
C. Images de cellules HEK293T (membranes plasmiques) obtenues en microscopie confocale (Zeiss LSM700). Rouge: Cy5, Vert: Alexa488. D. Variation de l'intensité de fluorescence du donneur et de l'accepteur au cours du photoblanchiment.

Ces protéines de 20 kDa, toutes deux dérivées de l’O⁶-alkylguanine-DNA alkyltransferase humaine (AGT), sont respectivement marquées de manière spécifique avec des composés de type O⁶-benzylguanine (BG) et O²-benzylcytosine (BC) portant un fluorophore. La protéine SNAP-tag est marquée avec un dérivé BG-AlexaFluor 488 (Alexa488) et la protéine CLIP-tag avec un dérivé BC-Cyanine 5 (Cy5) (Figure 2A). La forte proximité entre les fluorophores au sein de la protéine de fusion ainsi que le recouvrement du spectre d’émission du donneur (Alexa488) avec le spectre d’absorption de l’accepteur (Cy5) (Figure 2B, surface hachurée) sont deux conditions favorables à l’établissement d’un transfert d’énergie intramoléculaire (Figure 2A). Ce transfert d’énergie peut être mis en évidence par l’augmentation du signal de l’Alexa488 (500 - 600 nm) après photoblanchiment du Cy5 (Figure 2C, 2D). Dans cette expérience l’accepteur a été complètement photoblanchi c’est-à-dire jusqu’à ce que son signal (650 - 700 nm) après photoblanchiment se trouve au niveau du signal provenant de cellules voisines non transfectées (bruit de fond). L’efficacité du transfert d’énergie E_A dans cette expérience de photoblanchiment de l’accepteur peut être calculée à partir de la formule suivante :

E_A = F^D_post – F^D_pre / F^D_post = E × α × β

F^D_post représente le signal du donneur après photoblanchiment de l’accepteur et F^D_pre représente le signal du donneur avant photoblanchiment de l’accepteur. α est la fraction de donneur interagissant avec l’accepteur et β la fraction d’accepteurs photoblanchis par rapport à la fluorescence initiale de l’accepteur avant photoblanchiment (100 % dans cette expérience). Comme il s’agit ici d’une protéine de fusion avec en tandem les deux protéines SNAP-tag et CLIP-tag portant respectivement le fluorophore donneur et accepteur (rendement de marquage de SNAP-tag et CLIP-tag = 100 %), la valeur de α est égale à 1. De fait, la valeur de l’efficacité du FRET mesurée est égale à l’efficacité du FRET réelle. Dans cette expérience l’efficacité du FRET a été calculée à partir de la moyenne des mesures réalisées sur 30 cellules différentes. La valeur obtenue pour E est de 39 ± 6 % (± standard déviation). En ignorant les possibles changements d’orientation relatifs des moments dipolaires de l’émission du donneur et de l’absorption de l’accepteur on peut déterminer la distance apparente entre les deux fluorophores, d = 60 Å (ångström).

Plus généralement le DFRAP utilise la paire de protéines fluorescentes CFP/YFP. Cependant des travaux publiés en 2005 ont permis de mettre en évidence que le photoblanchiment de la YFP s'accompagne de l'apparition d'un signal de fluorescence dans le canal de la CFP et cela en absence de CFP[13]. Ces travaux montrent aussi que la Citrine et la Venus peuvent, après photoblanchiment, générer des espèces présentant une émission similaire à celle de la CFP. Le mécanisme de conversion de la eYFP, Citrine et Venus en CFP-like n'est à ce jour pas connu.

L’utilisation de la durée de vie de fluorescence du donneur est aussi une approche adaptée à la mesure des évènements de FRET. Cette méthode consiste à mesurer le déclin de fluorescence du donneur au cours du temps. Cela peut être réalisé aussi bien sur des populations de cellules au format microplaque, que par des techniques microscopiques. La base physique de cette approche repose sur le fait que la durée de vie d’une molécule fluorescente dépend notamment de l’efficacité du processus de FRET. Par conséquent, plus le transfert d’énergie entre les deux molécules est efficace plus le déclin de fluorescence du donneur est rapide. Le FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) est un exemple de technologie basée sur l’analyse de durée de vie[14]. Il est préférable avec ce type d’approche d’utiliser des molécules fluorescentes dont le déclin de fluorescence est monoexponentiel. La CFP par exemple est utilisée en FLIM en dépit de certains désavantages dus à son faible rendement quantique, son faible coefficient d’extinction molaire et surtout à son déclin de fluorescence qui présente deux exponentielles[15]. Ainsi, afin de faciliter l’analyse des durées de vie en FLIM des mutations de cette protéine ont permis de générer un variant nommé Cerulean plus lumineux que la CFP et présentant une décroissance monoexponentielle[16].

Figure 3. Les protéines GFP :
A. Structure cristallographique de la GFP (code pdb : 1EMB) ;
B. Spectres d’excitation et d’émission des variants de la GFP.

L’innovation probablement la plus importante dans le domaine des fluorophores fut marquée par la découverte d’une protéine fluorescente pouvant être directement encodée à l’intérieur de la cellule. Il s’agit de la GFP (Green Fluorescent Protein). L’exploitation de la GFP et la génération de variants de cette protéine ont permis le développement de technologies de FRET parfaitement adaptées à l’étude de la dynamique des interactions moléculaires dans l’espace et dans le temps à l’intérieur de cellules vivantes[17].

Initialement identifié chez la méduse Aequorea victoria, le gène codant la GFP a été cloné en 1992 par Prasher et coll. Cristallisée pour la première fois en 1974, il faudra attendre 1996 pour obtenir la structure tridimensionnelle de la GFP par diffraction de rayons X[18]. Cette protéine de 27 kDa se présente sous forme d’un cylindre de 30 Å (Ångström) de diamètre et 40 Å de hauteur composé de onze feuillets β (9 à 13 résidus par feuillet) qui entourent une hélice α contenant le chromophore (Figure 3.A). Le chromophore résulte d'une réaction spontanée de cyclisation des chaînes latérales de trois acides aminés (Sérine65 – Tyrosine66 – Glycine67) à l’intérieur du tonneau. L’organisation des feuillets β en formant une véritable cage, confère au chromophore son propre environnement[19].

La photoactivation de cette protéine dont le pic d’absorption majoritaire est à 395 nm entraîne une réaction autocatalytique provoquant l’émission d’une lumière verte avec un pic d’émission à 508 nm. Différentes protéines mutantes de la GFP ont été produites. En changeant, entre autres, la structure des trois acides aminés formant le chromophore, il a été possible de modifier les longueurs d'onde d'absorption et d'émission de la GFP devenant alors, une BFP (Blue Fluorescent Protein), une YFP (Yellow Fluorescent Protein) ou de nombreux autres variants bien caractérisés (CFP, RFP…) (Figure 3.B). L’utilisation de ces différents mutants comme sondes moléculaires en font des outils de choix aussi bien dans l’étude de l’expression de gènes, le suivi de protéines et leur compartimentalisation cellulaire que dans l’analyse des interactions protéine – protéine par des approches de transfert d’énergie. Concernant ce dernier point, deux paires de fluorophores ont été largement utilisées. Ces molécules BFP/GFP et CFP/YFP dérivées de la GFP présentent en effet des propriétés photophysiques compatibles avec la mise en place d’un transfert d’énergie.

Le point fort de cette technologie réside dans l’encodage des protéines fluorescentes. Il est donc possible de suivre en microscopie la localisation cellulaire des protéines avec une bonne résolution spatiale. De plus, grâce à la forte intensité de fluorescence des molécules utilisées, les phénomènes de transfert d’énergie peuvent être visualisés directement dans la cellule permettant de définir à la fois la nature des protéines en interactions, la dynamique de ces phénomènes et leur localisation cellulaire.

Dans le domaine des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) cette approche a été beaucoup utilisée pour caractériser la dimérisation des récepteurs (association par paire des protéines formant un récepteur fonctionnel). La fusion des GFP au niveau de la région carboxy-terminale des récepteurs a permis d’analyser leur organisation sans pour autant altérer leur structure, fonction ou localisation dans les travaux publiés. Le principal inconvénient de cette approche pour l’étude de la dimérisation vient de la nécessité de passer par la microscopie confocale. En effet, en microscopie classique par épifluorescence ou dans un fluorimètre il n’est pas possible de séparer le signal provenant des récepteurs de surface de celui des récepteurs retenus dans les compartiments intracellulaires. De plus, la difficulté de miniaturisation de cette approche en microplaque ne permet pas d’étendre ce type d’analyse à du moyen ou haut débit.

La sensibilité et la robustesse du signal HTRF font de cette technologie une approche parfaitement adaptée à l’étude des interactions entre biomolécules dans des systèmes de criblage à haut débit tel qu'il est pratiqué dans l'industrie pharmaceutique. Ainsi, une large variété de tests permettant de détecter de nombreux évènements biologiques a pu être développée. Parmi ces gammes de produits, a été mis au point une série de kits de dosage de seconds messagers permettant de mesurer l’activation des protéines Gs, Gi et Gq couplées à des RCPG[25] - [26]. Cette même société a mis en place une nouvelle plateforme de criblage des interactions protéine-protéine à la surface cellulaire. Cette plateforme tire profit de l'utilisation de ligands fluorescents[27] ainsi que de la technologie SNAP-tag [28] pour cibler spécifiquement des protéines d'intérêt (RCPG) avec des fluorophores donneur/accepteur, permettant une analyse des interactions protéine-protéine par FRET en temps résolu.

Transfert d’énergie intramoléculaire (changements conformationnels)

Figure 7. Transfert d’énergie intramoléculaire : sonde calcique[30].

Les techniques de transfert d’énergie sont des approches suffisamment sensibles pour mesurer des changements conformationnels intervenant au sein d’une protéine. Ceci est possible en incorporant les fluorophores donneur et accepteur à différentes positions de la protéine d’intérêt. Les points d’insertion sont choisis de manière que les changements conformationnels, en modifiant la distance et/ou l’orientation des fluorophores, entraînent des modifications du transfert d’énergie (augmentation ou diminution).

Le transfert d’énergie intramoléculaire a permis d’analyser les changements conformationnels intervenant au cours des processus d’activation des récepteurs membranaires. Ainsi, Vilardaga et coll. ont analysé les réarrangements intracellulaires induits par la fixation de molécules agonistes et antagonistes au niveau des récepteurs béta-2A-adrénergiques et des récepteurs aux hormones parathyroïdiennes[31]. Le même type d’analyse a permis d’étudier les changements conformationnels du récepteur aux androgènes[32].

De nombreuses sondes intracellulaires ont aussi été développées sur ce principe. L’objectif de ces systèmes est de pouvoir révéler l’activation d’une voie de signalisation particulière en mesurant les variations de concentrations de différents seconds messagers. La première sonde fluorescente appelée caméléon, a été développée par Miyawaki et coll. afin de mesurer les modifications de la concentration calcique à l’intérieur de la cellule[8] (Figure 7). À la suite de la fixation de quatre ions calcium au niveau de son domaine calmoduline, la sonde subit des changements conformationnels provoquant un rapprochement des fluorophores. L’augmentation du signal de FRET à 510 (GFP) ou 535 nm (YFP) est dépendante de la production calcique intracellulaire. Il est ainsi possible de mesurer en temps réel, les variations de la concentration calcique à l’intérieur de la cellule. D’autres sondes ont aussi été développées pour mesurer notamment la concentration en GMPc (Nikolaev et al., 2006) ou pour détecter simultanément l’activité de la PKA et de la PKC[33].