Protéine recombinante

Le vecteur est un moyen de transport de l'ADN. C'est un fragment capable de réplication autonome et qui peut supporter l'insertion d'un autre fragment d'ADN de taille variable (plasmide bactérien).

L'organisme donneur exprime la protéine d'intérêt. L'ARNm codant cette protéine est isolé de cet organisme. L'ARNm permet la synthèse de l'ADNc qui sera utilisé pour le clonage. En effet, l'ADN génomique eucaryote n'est pas utilisable dans un système bactérien car les bactéries ne possèdent pas la machinerie d'épissage des ARNm eucaryotes.

C'est pourquoi la technique RT-PCR est souvent utilisée pour l'obtention de l'ADNc codant le gène d'intérêt. À la suite de la transcription inverse des ARNm totaux en ADNsb (simple brin) grâce à des amorces poly dT spécifique des extrémités poly A des ARNm, l'ADNc correspondant à l'ARNm codant la protéine d'intérêt est amplifié par PCR en utilisant des amorces spécifiques auxquels sont ajoutés des sites de restrictions qui seront ensuite utilisés pour le clonage.

Séquences régulatrices

Une fois l'ADNc d'intérêt amplifié, il lui faut ajouter les séquences permettant de cibler le tissu de transcription ainsi que les signaux de terminaison de la transcription et de la traduction. Ces séquences sont souvent présentes sur le plasmide dans lequel est cloné le gène d'intérêt :

• En 5' : un promoteur spécifique du tissu dans lequel l'expression est attendue, ainsi qu'un intron dans le cas où la transgenèse est réalisée en modèle eucaryote.
• En 3' : un codon stop ainsi qu'un signal de polyadénylation.

Avec les bactéries il n'y a pas besoin d'introns.

ADN recombinant

L'ADNc amplifié par PCR est cloné dans un vecteur (chromosome artificiel bactérien, chromosome artificiel de levure, plasmide bactérien, etc.) contenant les séquences régulatrices décrites précédemment.

Pour cela, le vecteur (ici plasmide) ainsi que l'ADNc du gène d'intérêt sont digérés par des enzymes de restriction différentes afin d'orienter l'insertion de l'ADNc avant de liguer l'ADNc dans le plasmide à l'aide d'une ligase.

Le plasmide recombinant est ensuite introduit dans une bactérie, par transformation, afin d'amplifier le vecteur qui sera ensuite purifié. Avant de réaliser la transgenèse, le vecteur est linéarisé et les signaux de réplication bactériens ainsi que les gènes de résistances présents sur le plasmide sont éliminés par utilisation d'enzymes de restriction.

C'est une technique consistant à l'intégration d'un gène exogène au génome d'un organisme hôte. Le but de cette manipulation est de permettre à l'hôte de produire une protéine d'intérêt non produite par une espèce donnée ou bien de le produire en plus grande quantité (utilisé dans les activités de recherche)[3].

Il se fera en fonction de l'utilisation désirée de la protéine recombinante ainsi que des mécanismes cellulaires nécessaires à la production d'une protéine fonctionnelle :

• Bactéries : forte croissance, niveau de sécrétion variable mais pas de modification post-traductionnelle. Formation de corps d'inclusion si la protéine n'est pas sécrétée.
• Levures : faciles à cultiver, modifications post-traductionnelles, bonne expression mais faible capacité de sécrétion des grosses protéines.
• Champignons : bonne sécrétion, modifications post-traductionnelles mais parfois indésirables.
• Cellules de mammifères : production de grosses molécules possible mais faible rendement pour des couts élevés.
• Plantes : utilisées dans le cas de productions de plantes transgéniques permettant une résistance à des parasites ou à des pesticides (par exemple, le maïs Bt).
• Animaux : productions de grosses molécules, possibilité de consommer les protéines recombinantes dans l'alimentation, nécessite de grande structure pour l'élevage.

Pour les bactéries et les levures, le transgène sera soit introduit dans la cellule sur un plasmide, soit intégré au génome bactérien par double recombinaison homologue.

Chez les végétaux, l'intégration de l'ADN recombinant se fait grâce à un « canon à ADN », qui projette des micro-billes d'or ou de tungstène enrobées d'ADN ou par l'utilisation de bactéries capables de transférer de l'ADN à sa cellule hôte (par exemple, Agrobacterium tumefaciens).

Pour les animaux, l'injection d'une solution contenant l'ADN recombinant sous forme linéaire est effectuée dans le pronucleus mâle d'une cellule œuf avant l'étape de caryogamie. L'ADN injecté sera intégré au génome par les mécanismes de réparation de l'ADN de la cellule hôte. La drosophile, le poisson zèbre, le ver nématode, le poulet, le xénope, la souris sont des animaux très utilisés.

Exemple de transgenèse en modèle murin

L'ADN exogène est injecté dans le pronucleus mâle :

• Les œufs viables sont réimplantés dans une mère porteuse préparée à recevoir un embryon.
• Chez la souris porteuse, l'ADN injecté est intégré à l'ADN hôte par les mécanismes de réparation de l'ADN. Les souris transgéniques sont identifiées par réaction en chaîne par polymérase.
• Un croisement entre des souris sauvages et les souris transgéniques permet d'obtenir des souris hétérozygotes pour le transgène.
• Si nécessaire, un croisement entre deux souris hétérozygotes permet d'obtenir des souris homozygotes pour le transgène.

À la suite de sa production la protéine est purifiée grâce à des méthodes biochimiques comme la chromatographie sur colonne, la chromatographie en phase liquide à haute performance, etc.

Il est possible que le nombre de copies du transgène intégré soit insuffisant pour permettre une production de protéine d'intérêt en concentration satisfaisante pour son utilisation à grande échelle.

Au contraire, l'expression du gène transféré peut être muette. En effet, si ce dernier s'est intégré au niveau d'une région d'hétérochromatine, le gène ne se verra pas transcrit et donc pas exprimé.

L'intégration du transgène peut également avoir des conséquences néfastes sur le développement de l'organisme hôte :

• par un changement de besoin nutritionnel ;
• l'expression du transgène dans une zone non ciblée créant des traumatismes des tissus (expression ectopique) ;
• une surproduction du transgène menant à un phénotype délétère ;
• le blocage de l'expression d'un gène endogène si l'intégration s'est faite à l'intérieur de ce gène.