Perte de fluorescence induite par photoblanchiment

Avant que le photoblanchiment puisse avoir lieu, on doit injecter une protéine fluorescente dans les cellules (on utilise généralement une GFP), ce qui va permettre aux protéines ciblées d'émettre de la fluorescence et ainsi de pouvoir les suivre au cours du processus. Ensuite, on doit définir une région d'intérêt ; cette région d'intérêt initiale contient généralement la cellule en entier ou bien plusieurs cellules. En FLIP, le photoblanchiment a lieu juste en dehors de cette région d'intérêt, c'est pourquoi une région de photoblanchiment doit également être définie. On doit enfin déterminer une troisième région, celle où la mesure se fera. Un certain nombre de balayages initiaux doit être fait afin de d'identifier la fluorescence avant le photoblanchiment. Ces balayages serviront de contrôles auxquels on comparera les balayages photoblanchis. À la suite de cela, le photoblanchiment peut enfin avoir lieu. Entre chaque "pulse" de blanchiment, il est nécessaire de laisser du temps au matériel fluorescent pour revenir à son état initial. Il est également important de prendre plusieurs balayages de la région d'intérêt immédiatement après chaque pulse de blanchiment pour étude complémentaire approfondie[1]. Le changement du niveau de fluorescence dans la région d'intérêt peut ensuite être quantifié de trois façons différentes. La plus commune est de choisir l'emplacement, la taille et le nombre de régions d'intérêt en se basant sur une inspection visuelle des groupes d'images à disposition. Les deux autres, plus récentes mais plus fiables, consistent soit à détecter des zones de mobilité de sonde différente sur base d'image individuelle, soit à modéliser physiquement la perte de fluorescence des corps en mouvement[2].

La perte de fluorescence est définie par la fraction mobile, ou la fraction de fluorochromes capables de revenir à leur état initial au sein d'une zone photoblanchie, de la protéine tagguée pour fluorescer. Une perte incomplète de fluorescence indique qu'il y a des fluorochromes qui ne bougent pas, ou bien qui transitent vers la zone blanchie. Cela permet d'identifier la fraction immobile, ou la fraction de fluorochromes incapable de revenir à son état initial au sein d'une zone photoblanchie, des protéines tagguées pour fluorescer. L'immobilité indique qu'il y a des protéines pouvant se trouver dans des compartiments isolés du reste de la cellule, les empêchant d'être affectées par le photoblanchiment répété[3].

La FLIP est souvent utilisée en étroite association avec la FRAP (redistribution de fluorescence après photoblanchiment). La différence majeure entre ces deux techniques de microscopie réside dans le fait que la FRAP implique l'étude de la capacité d'une cellule à se remettre d'un seul événement de photoblanchiment alors que la FLIP implique l'étude de comment la perte de fluorescence se répand à travers la cellule après de multiples événements de photoblanchiment. Cette différence d'objectif conduit également à une différence dans les parties de la cellule qu'on observe. En FRAP, la zone qui est vraiment photoblanchie correspond à la zone d'intérêt. À l'inverse, en FLIP, la région d'intérêt est juste à l'extérieur de la région qui est photoblanchie. Une autre différence importante est qu'en FRAP, il n'y a qu'un seul événement de photoblanchiment ainsi qu'une période de récupération afin d'observer à quel point les fluorochromes retournent de façon efficace au site blanchi ; alors qu'en FLIP, des événements multiples de photoblanchiment ont lieu afin d'empêcher le retour des fluorochromes non blanchis à la région de blanchiment. Comme la FLIP, la FRAP est utilisée dans l'étude de la continuité des organites à membrane. Ces deux techniques sont souvent utilisées ensemble afin de déterminer la mobilité des protéines tagguées à la GFP[3]. La FLIP peut aussi être utilisée pour mesurer le transfert moléculaire entre des régions d'une cellule sans tenir compte du taux de mouvement. Cela permet d'avoir une analyse plus poussée du trafic de protéines au sein d'une cellule. Cela diffère de la FRAP qui est principalement utile pour déterminer la mobilité des protéines uniquement dans les régions où a lieu le photoblanchiment[5].

Il y a plusieurs complications qu'impliquent à la fois la FLIP et la FRAP. Comme ces deux techniques de microscopie observent des cellules vivantes, il y a toujours la possibilité que les cellules bougent, ce qui fausse les résultats. La meilleure façon d'éviter cela est d'utiliser un algorithme d'alignement, qui va compenser chaque mouvement et éliminer une large partie de l'erreur due au mouvement. Dans ces expériences, il est également capital d'avoir un groupe contrôle afin d'ajuster les résultats et corriger la courbe de récupération pour la perte globale de fluorescence[3]. Une autre façon de minimiser l'erreur est de restreindre le photoblanchiment au niveau d'une seule région ou d'une seule zone. Cette limitation va jouer le rôle de contrôle et va limiter la perte de fluorescence due au photo-dommage par rapport à la perte de fluorescence due au photoblanchiment[3].