Séquençage par nanopores

Vue d'une molécule d'hémolysine alpha.

L'hémolysine alpha est un nanopore provenant de la bactérie Staphylococcus aureus[5] qui provoque la lyse des globules rouges[6]. C'est un pore transmembranaire hépatique d'environ 10 nm de long relié à deux canons transmembranaires d'une longueur de 5 nanomètres (nm). La structure de l'hémolysine alpha est avantageuse pour identifier des bases spécifiques qui se déplacent à travers elle. Ainsi, des études ont démontré que les 4 bases azotées constituant l'ADN peuvent être identifiées par le courant ionique mesuré à travers ce nanopore. Sa structure intrinsèque lui permet également de détecter d'autres petits analytes, par exemple des ions métalliques et des petites molécules organiques[5] - [7].

Ces protéines sont capables de s'introduire de manière spontanée dans la bicouche des membranes cellulaires. Elles sont très résistantes au pH et sont stables thermiquement. Elles fonctionnent à des températures qui atteignent les 100 degrés Celcius[5].

Des travaux sont menés afin d'amener ce nanopore à pouvoir séquencer de longues lectures en y liant une exonucléase, permettant ainsi la séparation des bases. L'hémolysine alpha serait alors capable de les identifier successivement puisque le couplage avec l'enzyme aurait pour conséquence, en plus de séparer les bases, de ralentir la translocation de l'ADN à travers le pore[8].

Illustration d'une molécule de MspA

La mycobactérie smegmatis porine (MspA) est un autre nanopore biologique qui permet de séquencer l'ADN[5]. C'est un pore avec une structure quaternaire octamérique en forme d'entonnoir[9]. Cette structure est davantage favorable au séquençage que celle de l'hémolysine alpha[10]. Cette protéine a pour fonction le transport des molécules solubles dans l'eau à travers les membranes des cellules bactériennes[9]. Ce sont les canaux MspA qui s'insèrent dans une bicouche membranaire qui sont considérés comment étant les nanopores. MspA est robuste, résistante aux variations de pH[11] et fonctionne à des températures variant de 80 à 100 degrés Celsius[5].

Malgré le fait qu'elle possède une structure avantageuse, cette protéine possède un noyau négatif qui empêche la translocation de l'ADN simple brin. Ce nanopore est donc modifié, lorsqu'il est utilisé pour améliorer la translocation, en remplaçant les trois acides aminés chargés négativement qui le composent, soit les acides aspartiques, en asparagine, un acide aminé neutre. De cette façon, la détection du courant électrique des nucléotides est dix fois plus spécifique que dans le cas de l'hémolysine alpha[12].

Il existe d'autres nanopores biologiques tels que le CsgG et le Phi29 (en)[5], mais ceux-ci n'ont pas encore fait leur preuve au niveau de leur capacité à permettre le séquençage de l'ADN.

Les chercheurs visent à raffiner la méthode afin d'améliorer la résolution et détecter des bases uniques[16]. Pour ce faire, deux aspects doivent être améliorés : la résolution et la vitesse de translocation.

Il existe deux types de résolutions : la résolution spatiale et la résolution temporelle[5]. Pour ce qui est de la résolution spatiale, comme les brins d'ADN ont plusieurs mètres de long, il est difficile de distinguer le signal d'un seul nucléotide. Quant à la résolution temporelle, il est difficile d'en obtenir une satisfaisante puisque l'ADN est en constant mouvement lors de la translocation et qu'il bouge selon certaines fluctuations. Il n'y a donc aucun moyen d'être certain du nombre exact de bases qui ont traversé le pore puisque les variations cinétiques occasionnent des signaux électriques qui diffèrent pour des séquences d'ADN identiques[5].

Puisque l'ADN possède une vitesse de translocation supérieure aux limites de détection électronique, la vitesse de translocation de l'ADN doit être contrôlée. Il a notamment été suggéré de créer deux sites de reconnaissance sur un nanopore d'hémolysine alpha afin augmenter les chances de reconnaissance d'une base[5] - [17].

Liens phosphodiester

Lorsque les liaisons phosphodiester sont brisées, le nucléotide qui est libéré ne se déplace pas à tous les coups vers l'endroit voulu, par exemple, vers le nanopore où il devrait être séquencé[18]. Ce problème pourrait être résolu en liant l'exonucléase au nanopore où devrait se diriger le nucléotide. Ainsi, les chances qu'ils se dirigent dans cette direction serait augmentée, mais encore une fois, ne serait pas garanti[5].

Le séquençage de l'ADN par les nanopores engendre une certaine incertitude mal quantifiée. Ainsi, par exemple, le pore d'hémolysine alpha possèderait une marge d'erreur plus élevée (10 à 25 %) que celle du MspA, avec lequel un taux d'erreur de 4 % a été déclaré par l'Oxford Nanopore Technologies[5].