Dépyrogénation

Étant donné que le poids moléculaire des endotoxines peut varier considérablement (de 10 000 à 1 000 000 Da), les taux d'endotoxines sont mesurés en "unités d'endotoxines" (UE). Un UE est approximativement équivalente à 100 pg de lipopolysaccharide de E. coli, quantité présente dans environ 10⁵ bactéries. L’humain peut développer des symptômes lorsqu’il est exposé à une masse corporelle d’à peine 5 EU/kg. Fièvre, hypotension artérielle, fréquence cardiaque accrue et faible débit urinaire font partie de ces symptômes. Même de petites doses d'endotoxines dans le sang sont souvent mortelles.

La FDA a fixé les niveaux maximaux d’endotoxines admissibles suivants pour les médicaments distribués aux États-Unis:

• Médicament (injectable par voie intrathécale) - 0,2 UE/kg de poids corporel
• Médicament (injectable, sauf voie intrathécale) - 5 EU/kg de poids corporel
• Eau stérile - 0,25-0,5 UE/ml (en fonction de l'utilisation prévue)

Les pyrogènes peuvent souvent être difficiles à éliminer de la solution en raison de la grande variabilité de poids moléculaire. Les pyrogènes sont également relativement stables thermiquement et insensibles aux changements de pH. Cependant, plusieurs techniques d'élimination existent .

Chromatographie par échange d'ions

Les endotoxines sont chargées négativement et vont se lier à un échangeur d'anions. Si la substance cible n'est pas également chargée négativement, elle passera dans la colonne avant l'endotoxine et une séparation efficace peut être réalisée. Cette méthode est parfois utilisée dans la purification des albumines (détails ci-dessous). Des ligands d'affinité connue pour les endotoxines peuvent être couplés à un système d'échange d'anions pour augmenter sa force de liaison aux endotoxines et améliorer encore la pureté du produit final. Des exemples typiques de ligands de liaison aux endotoxines comprennent l'histamine, des composés hétérocycliques contenant de l'azote et la polymyxine B. Cependant, il est connu que la polymyxine B induit la production d'interleukine-1, un pyrogène exogène, et il doit donc être démontré qu'elle est absente du produit final.

Exemple d'utilisation de la chromatographie par échange d'anions pour purifier l'albumine (Uppsala):

• 2% de l'endotoxine ne se lie pas à la colonne. Toutefois, ces 2% sont éliminés avant le pic d’albumine et peuvent donc être éliminés simplement en commençant la collecte après l’élimination de ces 2%.
• 10% de l'endotoxine qui ne se lie à la colonne (9,8% du total d'origine) finira par se laver après le pic de l' albumine. Pour éviter de contaminer le produit final, on arrête sa collecte avant que cela ne se produise.
• Les 90% restants de l'endotoxine liée (88,2% du total initial) doivent être nettoyés de la colonne à l'aide de NaOH.

Une alternative à l'échange d'anions est la chromatographie par échange de cations, dans laquelle des solutés chargés positivement se lient au support chromatographique solide. Dans cette méthode, la cible se lie à la colonne au lieu de l'endotoxine. L'endotoxine est ensuite lavée à travers la colonne et une cible pure est ensuite éluée de la colonne. Il a été démontré que la chromatographie par échange de cations purifie efficacement le β-interféron. (Dembinski et al.)

Ultrafiltration

Étant donné que le poids moléculaire des endotoxines est généralement supérieur à 10 kD, l’ultrafiltration peut parfois être utilisée pour effectuer une séparation en fonction de la taille. En raison de la grande variabilité de la taille des endotoxines, il peut être difficile de sélectionner la membrane appropriée. Cette méthode est donc mieux utilisée uniquement lorsque toutes les endotoxines présentes sont supérieures à 300 000 Da. Il a été démontré que des ultra-filtres disponibles dans le commerce peuvent éliminer les pyrogènes à un niveau inférieur à 0,001 UE/ml.

Distillation

Cette méthode est également basée sur le poids moléculaire élevé et la stabilité à la chaleur des endotoxines. Les solvants de bas poids moléculaire peuvent être facilement purifiés en faisant bouillir et en recueillant la vapeur condensée dans un récipient exempt d'endotoxines (voir "chauffage" ci-dessous). Les grosses molécules de LPS ne se vaporisent pas facilement et restent donc dans le récipient de chauffage. C'est la méthode de choix pour la purification de l'eau.

Étant donné que les pyrogènes sont souvent difficiles à éliminer, l’inactivation ou la destruction de la molécule de LPS peut parfois être préférable.

Hydrolyse acide-base

Il a été démontré que cette méthode clive le LPS en lipide A et polysaccharide (voir à droite). Le fragment lipidique isolé n'est pas soluble dans l'eau. Ainsi incapable de se lier aux cellules endothéliales, il est rendu inactif. Cependant, l'hydrolyse acide-base peut dénaturer une protéine cible et est donc inappropriée lors de la purification d'une protéine.

Oxydation

L'oxydation à l'aide de peroxyde d'hydrogène est souvent utilisée comme solution de destruction de pyrogène à faible coût. Le mécanisme de cette destruction est inconnu, mais le peroxyde d'hydrogène peut facilement être éliminé plus en aval lors du processus de purification et constitue donc un procédé utile d'élimination des pyrogènes. Cependant, comme l'hydrolyse acide-base, il ne convient pas pour la purification des protéines.

Chauffage

Des méthodes de chauffage sont souvent utilisées pour s'assurer que le verre et les autres équipements de laboratoire sont exempts de matières pyrogènes. La chaleur est appliquée par cuisson dans un four à chaleur sèche spécialement conçu pour le processus de dépyrogénation. Bien que les endotoxines soient relativement stables thermiquement, un chauffage suffisant (250 °C pendant 30 min) entraîne une réduction de 3 logs des niveaux d'endotoxines. En raison des niveaux élevés de température, cette méthode ne convient pas non plus lors de la purification des protéines. On fait la différence entre F0 pour la fonction humide et Fh pour la fonction sèche selon la formule[2] :

${\displaystyle F_{Z}^{T}=\int _{sd}^{tt}10^{\tfrac {Tref-T}{Z}}.dt}$ ou ${\displaystyle \Delta t\sum 10^{\tfrac {Tref-T}{Z}}}$

Hydroxyde de sodium

Lors de la purification des protéines, l’hydroxyde de sodium (NaOH) peut être utilisé efficacement et en toute sécurité. Il est également largement utilisé pour la dépyrogénation d’équipements non traitables en autoclave, par exemple les matières plastiques, ou en colonnes de chromatographie. En fait, lorsqu’on utilise un échangeur d’anions pour éliminer les pyrogènes, il est nécessaire de nettoyer la colonne avec NaOH après chaque lot.

Étant donné que pratiquement toutes les matières premières entrant dans un processus de production, y compris les employés d’usine, peuvent constituer des sources potentielles de contamination par pyrogène, le criblage et la dépyrogénation des matières premières peuvent souvent contribuer grandement à garantir que le produit final ne contient pas de pyrogènes et ne nécessite pas d’enlèvement coûteux ou autre méthode d'inactivation. L'ultrafiltration de produits chimiques et de solutions tampons, l'application de pratiques d'hygiène appropriées et la réalisation de tests réguliers peuvent tous être utiles.

• Lipopolysaccharide

• Mise à jour LAL
• Dépyrogenation LAL Update
• Sofer, G .; Hagel, L. (1997). Manuel de chromatographie de processus: Guide d'optimisation, de mise à l'échelle et de validation. Academic Press, 158-161. (ISBN 0-12-654266-X)
• Bureau des affaires réglementaires de la FDA: Guide technique d’inspection, endotoxines bactériennes / pyrogènes
• Manuel de bactériologie
• Utilisations médicales du crabe fer à cheval
• Élimination chromatographique des endotoxines et / ou de l'éthanol de l'albumine. Note d'application 206. Pharmacia Biotech., Uppsala, 1990.
• Dembinski, W .; O'Malley, JA; Sulkowski, E. Procédure de purification à grande échelle pour l'interféron de fibroblastes humains. Mémorandum scientifique sur l'interféron , janvier / Févr. 6 (1983).
• Tours, N. et Sandle, T. Comparaison de la dépyrogénation par chaleur sèche à l'aide de trois types différents d'endotoxines bactériennes à Gram négatif, Revue européenne de sciences parentérales et pharmaceutiques, volume 13, n ° 1, 2008, p.
• Une approche pratique des études de dépyrogénation utilisant des endotoxines bactériennes