Polymorphisme de longueur des fragments de restriction terminaux

La TRFLP est l'une des nombreuses méthodes moléculaires visant à obtenir l'empreinte moléculaire d'une communauté microbienne inconnue. Il existe d'autres méthodes similaires comme la DGGE, la TGGE, l'ARISA, l'ARDRA, la PLFA, etc.

Ces méthodes à débit relativement élevé ont été développées afin de réduire les coûts et les efforts liés à l'analyse de communautés microbiennes à l'aide d'une bibliothèque de clones. La méthode a été décrite pour la première fois par Liu et ses collaborateurs en 1997[1] qui utilisaient l'amplification du gène cible de l'ADNr 16S à partir de l'ADN de plusieurs bactéries isolées ainsi que d'échantillons environnementaux. Depuis lors, la méthode a été appliquée à l’utilisation d’autres gènes marqueurs, tels que le gène marqueur fonctionnel pmoA, pour analyser les communautés méthanotrophes.

Comme la plupart des autres méthodes d'analyse communautaire, la TRFLP est également basée sur l'amplification par PCR d'un gène cible. Dans le cas de la TRFLP, l'amplification est réalisée avec une ou les deux amorces dont l'extrémité 5' est marquée avec une molécule fluorescente. Si les deux amorces sont taggées, différents fluorochromes sont nécessaires. Plusieurs fluorochromes courants peuvent être utilisés pour le marquage, tels que la 6-carboxyfluorescéine (6-FAM), le ROX, la carboxytétraméthylrhodamine (TAMRA, à base de rhodamine) et l'hexachlorofluoréscéine (HEX); le fluorochrome le plus largement utilisé est la 6-FAM. Le mélange d'amplicons est ensuite soumis à une réaction de restriction, en utilisant habituellement une enzyme de restriction à quatre coupes. Après la réaction de restriction, le mélange de fragments est séparé par électrophorèse capillaire ou en gel de polyacrylamide dans un séquenceur d’ADN et la taille des différents fragments terminaux est déterminée par le détecteur de fluorescence. Étant donné que le mélange d’amplicons excisé est analysé dans un séquenceur, seuls les fragments terminaux (c’est-à-dire les extrémités marquées de l’amplicon) sont lus tandis que tous les autres fragments sont ignorés. Ainsi, la TRFLP est différente de l'ARDRA et de la RFLP dans lesquelles tous les fragments de restriction sont visualisés. En plus de ces étapes, le protocole de la TRFLP inclut souvent un nettoyage des produits de PCR avant la restriction et dans le cas où une électrophorèse capillaire est utilisée, une étape de dessalage est également effectuée avant l'analyse de l'échantillon.

Le résultat d'un profilage TRFLP est un graphique appelé électrophorégramme, qui est une représentation graphique d'intensité d'une expérience d'électrophorèse (en gel ou capillaire). Dans un électrophorégramme, l'axe des abscisses marque la taille des fragments, tandis que l'axe des ordonnées indique l'intensité de la fluorescence de chaque fragment. Ainsi, ce qui apparaît sur un gel d'électrophorèse sous forme de bande apparaît sur l'électrophorégramme sous forme de pic dont l'intégrale donne la fluorescence totale. Dans un profil TRFLP, chaque pic correspond généralement à un variant de l'échantillon initial, tandis que sa hauteur ou sa surface correspond à son abondance relative dans la communauté spécifique. Les deux hypothèses énumérées ci-dessus ne sont toutefois pas toujours vérifiées. Souvent, plusieurs bactéries différentes dans une population peuvent donner un seul pic sur l'électrophorégramme en raison de la présence d'un site de restriction pour l'enzyme de restriction particulière utilisée dans l'expérience à la même position. Pour résoudre ce problème et augmenter la résolution de cette technique, un seul échantillon peut être digéré en parallèle par plusieurs enzymes (souvent trois), ce qui donne trois profils TRFLP par échantillon, chacun déterminant certains variants et pas d'autres. Une autre modification parfois utilisée consiste à marquer de manière fluorescente l’amorce inverse en utilisant également un fluorochrome différent, ce qui aboutit à nouveau à deux profils parallèles par échantillon, chacun déterminant un nombre différent de variants.

En plus de la convergence de deux variants génétiques distincts en un seul pic, des artefacts peuvent également apparaître, principalement sous la forme de faux pics. Les faux pics sont généralement de deux types : les pics « bruit de fond » et les « pseudo-TRF »[2]. Les pics de bruit de fond résultent de la sensibilité du détecteur utilisé. Ces pics ont souvent une intensité faible et posent généralement problème si l'intensité totale du profil est trop faible (c'est-à-dire une faible concentration d'ADN). Étant donné que ces pics correspondent à du bruit de fond, ils ne sont généralement pas reproductibles dans les profils de réplication. Le problème peut donc être résolu en créant un profil de consensus à partir de plusieurs réplicats ou en éliminant les pics inférieurs à un certain seuil. Plusieurs autres techniques de calcul ont également été introduites afin de traiter ce problème[3]. Les pseudo-TRF, en revanche, sont des pics reproductibles et sont proportionnels à la quantité d’ADN chargée. On pense que ces pics sont le résultat d’un annelage de l’ADNsb (simple brin) sur lui-même et de la création de sites de restriction aléatoires à double brin qui sont ensuite reconnus par l’enzyme de restriction, ce qui donne un fragment terminal qui ne représente aucun variant génétique véritable. Il a été suggéré que l'application d'une activité ADN exonucléase telle que l'exonucléase du haricot mungo avant l'étape de digestion pourrait éliminer un tel artefact.

Les données résultant de l'électrophorégramme sont généralement interprétées de l'une des manières suivantes.

Comme la TRFLP est une technique d’empreinte génétique, ses avantages et inconvénients sont souvent débattus par rapport à d’autres techniques similaires, principalement la DGGE.