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Focalisation isoélectrique

La focalisation isoélectrique (IEF de l'anglais isoelectric focusing ou electrofocusing) est une technique de séparation des molécules, tel que les protéines, par des différences dans leur point isoélectrique. C'est un type d'électrophorèse de zone.

Elle a des applications autant préparatoires qu’analytiques. Elle est principalement utilisée dans le domaine de la biochimie. Elle sert essentiellement à séparer les protéines les unes des autres en fonction de leur point isoélectrique unique[1].

Bien que les chercheurs Ikeda et Suzukion furent les premiers à remarquer que les acides aminés séparés d’une protéine formaient un gradient de pH lorsque placés entre deux électrodes, c’est au biophysicien russe Alexander Kolin que l’on attribue la plus grande contribution au développement de la focalisation isoélectrique. C’est en se basant sur les notions déjà appliquées à l’électrophorèse à son époque que l’ancien professeur de l’Université de Californie à Los Angeles a développé la focalisation isoélectrique en 1954[1]. Cette technique est si étroitement liée à l’électrophorèse qu’on l’appelle aussi électrophorèse isoélectrique[2].

De plus, bien que l’exĂ©cution de cette technique Ă©tait plutĂ´t longue et fastidieuse Ă  ses balbutiements dans le milieu des annĂ©es cinquante[3], la focalisation isoĂ©lectrique est aujourd’hui l’une  des techniques les plus utilisĂ©es pour la sĂ©paration et la caractĂ©risation des protĂ©ines d’un mĂ©lange. En effet, grâce Ă  son pouvoir de rĂ©solution inĂ©galĂ© et Ă  sa compatibilitĂ© avec un large Ă©ventail de mĂ©thodes de sĂ©parations, l’électrofocalisation est prĂ©sentement une mĂ©thode indispensable Ă  quiconque entreprenant l’étude des protĂ©ines[1].

Principe de base

Le point isoélectrique

Les sĂ©parations par IEF sont basĂ©es sur les propriĂ©tĂ©s de charge des molĂ©cules. Comme il a Ă©tĂ© mentionnĂ© lors de l’introduction, il s’agit plus particulièrement du point isoĂ©lectrique unique de chaque molĂ©cule qui est utilisĂ© afin de les sĂ©parer et de les purifier Ă  partir d’un mĂ©lange. En fait, le point isoĂ©lectrique se dĂ©finit comme Ă©tant le pH spĂ©cifique oĂą une molĂ©cule ne possède aucune charge Ă©lectrique nette. C’est donc pour cette raison que l’IEF s’applique spĂ©cifiquement Ă  la sĂ©paration de molĂ©cules amphotères qui peuvent agir Ă  la fois comme un acide ou une base[1].  Les acides aminĂ©s formant les protĂ©ines Ă©tant des zwitterions, soient « des espèces ioniques qui portent simultanĂ©ment une charge positive et une charge nĂ©gative »[4], c’est pour cette raison que la focalisation isoĂ©lectrique est particulièrement utilisĂ©e afin de procĂ©der Ă  la sĂ©paration des espèces protĂ©iques d’un mĂ©lange.

L'introduction d'un courant Ă©lectrique

Lors de la focalisation isoĂ©lectrique, c’est  par l’introduction d’un courant Ă©lectrique que la migration des espèces chargĂ©es est induite. En effet, une diffĂ©rence de potentiel est appliquĂ©e entre une anode et une cathode afin de faire migrer les molĂ©cules chargĂ©es positivement vers la cathode et celles chargĂ©es nĂ©gativement vers l'anode. Par contre, la sĂ©paration des molĂ©cules protĂ©iques d’intĂ©rĂŞt ne peut ĂŞtre atteinte en l’absence d’un gradient de pH[2].

Le gradient de pH

À un pH donné, soit à l’atteinte du point isoélectrique, les protéines se retrouvent nécessairement sans charge nette, celles-ci arrêtent de migrer sous l’effet du champ électrique induit. Alors, les protéines possédant toutes un point isoélectrique différent, celles-ci se concentrent dans une zone bien définie où le pH du gradient est égal à leur point isoélectrique. C’est donc la combinaison du gradient de pH avec le passage d’un courant électrique à travers l’analyte qui permet vraiment la séparation des polypeptides de ce dernier[1].

Le gradient de pH étant un paramètre clé de la focalisation isoélectrique, sa nature détermine largement la qualité de la séparation. Les deux principales façons d’obtenir un gradient de pH sont les suivantes[1]:

Capillaire

Le gradient de pH est gĂ©nĂ©rĂ© Ă  l’aide d’une solution tampon de plusieurs ampholytes ayant un point isoĂ©lectrique diffĂ©rent soumise Ă  un courant Ă©lectrique. Il est Ă  noter que « les ampholytes sont des composĂ©s amphotères qui contiennent habituellement des groupements acide carboxylique et amine Â»[2]. Il est d’ailleurs possible de prĂ©parer en laboratoire ces solutions aqueuses d’ampholytes couvrant des gammes de pH diffĂ©rents selon les molĂ©cules Ă  sĂ©parer ou de se les procurer commercialement.

Avec cette technique, les analytes sont dissous dans une solution d’ampholytes dans un tube capillaire placé entre une cathode, où se trouve un électrolyte basique, et une anode, où se trouve un électrolyte acide. Une fois la tension constante appliquée aux bornes des électrodes, les cations, les anions et les différents ampholytes migrent d’un côté ou de l’autre de la cellule d’électrophorèse, les plus acides à l’anode et les plus basiques à la cathode, créant ainsi un gradient de pH dans lequel les analytes peuvent migrer, jusqu’à ce qu’ils atteignent une zone de pH où leur charge nette est nulle. Les différents analytes, habituellement de nature peptidique, arrêtent alors de migrer, puisque leur charge nette est de zéro, et ils sont alors séparés en fonction de leur point isoélectrique[2].

Cette mĂ©thode par capillaire permet d’utiliser un plus grand champ Ă©lectrique puisque l’étroitesse du capillaire permet une diminution de la tempĂ©rature plus rapidement. Un plus grand champ Ă©lectrique permet de diminuer le temps de sĂ©paration de quelques minutes. Cette technique diminue Ă©galement l’étalement des bandes par diffusion, ce qui les rendent plus nettes. Cependant, elle permet seulement de sĂ©parer une petite quantitĂ© de molĂ©cules. L’électrophorèse en capillaire a une bonne rĂ©solution et peut ĂŞtre automatisĂ©e, un peu comme la chromatographie en phase liquide Ă  haute performance. Elle permet l’analyse d’une plus grande quantitĂ© de molĂ©cules, on peut analyser des protĂ©ines, des acides nuclĂ©iques, des peptides, des glucides, des cations, des anions, des vitamines, des pesticides des virus et mĂŞme des cellules entières[5].    

Sur gel

Le gradient de pH mobile est généré dans le gel de polyacrylamide par les ampholytes liés aux unités d’acrylamides de façon à créer un gradient de pH d’un bout à l’autre du gel lors du passage d’un courant électrique. Il s’agit d’un gel synthétique qui peut être acheté commercialement[5].

Ce gel est préparé en utilisant des ampholytes, qui sont porteurs de charges et tout comme les protéines, possèdent des points isoélectriques différents. On doit soumettre un courant électrique aux ampholytes afin d’obtenir un gradient de pH qui augmente vers la cathode. Par la suite, la charge nette pour les ampholytes sera nulle, donc les molécules ne bougeront plus et on aura un gradient de pH immobile. Cette technique de la formation du gradient de pH permet d’obtenir un gradient qui est stable pour la séparation de molécules par focalisation isoélectrique[6].

Les ampholytes peuvent ĂŞtre Ă©galement liĂ©s Ă  l’acrylamide polymĂ©risĂ© afin de crĂ©er un gel avec gradient Ă  pI immobilisĂ©. Ce type de gel permet d’éviter un problème qui peut ĂŞtre prĂ©sent lorsque l’on utilise la focalisation isoĂ©lectrique, soit la dĂ©rivation cathodique, oĂą le gradient de pH va se dĂ©sintĂ©grer avec le temps. Cette mĂ©thode pour la formation du gradient permet donc une plus grande reproductibilitĂ© et permet l’analyse d’un plus grand nombre de molĂ©cules en mĂŞme temps puisque le gradient de pI est plus stable. Un second phĂ©nomène qui peut changer le gradient de pH et la rĂ©solution est l’électroosmose. Cela est observĂ© lorsque la matrice ou une partie de l’équipement qui sont en contact directe avec le gel portent une charge[6].    

Avec cette mĂ©thode sur gel, l’échantillon liquide contenant les analytes peut ĂŞtre introduit Ă  n’importe quel endroit sur le gel de polyacrylamide  et les protĂ©ines migreront spontanĂ©ment vers l’anode ou la cathode jusqu’à l’atteinte de leur point isoĂ©lectrique, en prĂ©sence d’un courant Ă©lectrique. Comme pour la technique prĂ©cĂ©dente, les protĂ©ines seront alors sĂ©parĂ©es selon leur point isoĂ©lectrique[5].

Il est à noter que c’est le gel de polyacrilamide qui est le plus souvent utilisé de nos jours et que la focalisation isoélectrique est souvent couplée à l’électrophorèse sur gel 2D qui permet une meilleure séparation en fonction du poids de la molécule[1].

Mobilisation

Une fois les protéines séparées en bandes lors de l’IEF, il est nécessaire de faire la détection des différentes protéines séparées afin d’en faire l’analyse. Pour ce faire, deux techniques sont utilisées afin de mener les protéines au détecteur se situant à l’une des extrémités d’un capillaire[2]

Mobilisation hydrodynamique

Cette technique consiste à appliquer une différence de pression en direction du détecteur afin que s’écoulent les zones focalisées vers celui-ci. Il est à noter que cette technique a pour effet de mélanger les zones focalisées. Elle est donc plutôt inefficace.

Mobilisation chimique

Cette technique consiste à modifier le gradient de pH dans le capillaire en ajoutant un sel neutre à l’une des deux électrodes, par exemple à l’anode, ce qui aura pour effet d’entraîner les bandes focalisées vers le détecteur à la cathode où le pH sera diminué. Ce sont les bandes ayant un point isoélectrique élevé qui seront détectées en premier.

De plus, lors de l’utilisation de la méthode d’IEF par gel, des marqueurs colorés ou l’absorption UV sont utilisés afin de détecter les protéines séparées. Il est à noter qu’il faut d’abord éliminer les ampholytes du gel avant de procéder au marquage, sans quoi les ampholytes seront eux aussi marqués[7].

Montage (sur gel)

Matrices

Les gels pour la focalisation isoĂ©lectrique peuvent ĂŞtre achetĂ©s ou faits soi-mĂŞme et il existe plusieurs longueurs et diffĂ©rentes variations pour le gradient de pH qui sert Ă  avoir une meilleure sĂ©paration selon l’utilisation. Se procurer un gel provenant d’une compagnie spĂ©cialisĂ©e permet d’économiser du temps et permet Ă©galement de s’assurer de la qualitĂ© du gel. Afin de choisir un gel appropriĂ©, voici quelques Ă©lĂ©ments qui peuvent aider :

  • Utiliser une plus petite bande pour l’étude de la protĂ©ine la plus abondante.
  • Une plus grande longueur permet d’avoir une plus grande rĂ©solution et aussi d’avoir plus de molĂ©cules en mĂŞme temps sur le gel.
  • Pour une dĂ©sintĂ©gration totale des protĂ©ines, utiliser un gradient de pH de 3 Ă  10.
  • Utiliser un petit Ă©cart de pH pour le gradient afin d’étudier une protĂ©ine dĂ©sirĂ©e dont le pI est connu.
  • Combiner des bandes avec des gradients qui se chevauchent pour une plus grande prĂ©cision. Par exemple, une bande avec un gradient qui est de pH 4 Ă  7 et une autre qui a un gradient qui passe de 6 Ă  11[6]

La polyacrylamide est la matrice la plus utilisĂ©e pour le gel de la focalisation isoĂ©lectrique. Cependant, on peut Ă©galement utiliser un gel d’agarose qui permet d’avoir des pores de plus grande taille, permet une coloration et dĂ©coloration rapide et n’est pas toxique, contrairement au polyacrylamide qui provient de l’acrylamide, qui est toxique[8]. Le gel d’agarose est utilisĂ© pour l’électrophorèse des protĂ©ines et Ă©galement des acides nuclĂ©iques.  

Pour empêcher que la porosité n’affecte la vitesse de migration des petites protéines par rapport aux grosses, un gel d’une concentration en acrylamide de 5 à 6 pour cents est satisfaisant, sauf pour les protéines volumineuses, où il faut utiliser des concentrations en bas de 4 pour cent[9]. Par contre, il est à noter que les gels ayant une concentration en acrylamide inférieure à 4 % sont très difficiles à manipuler, puisqu’ils sont très fragiles. Pour remédier à la situation, est possible d’ajouter de l’agarose pour augmenter légèrement la rigidité de la matrice sans influencer la mobilité des protéines.

On doit Ă©galement tenir compte de l’affinitĂ© des protĂ©ines pour la matrice utilisĂ©e, donc si une protĂ©ine a une plus grande affinitĂ©, elle migrera moins vite que les autres protĂ©ines. Une matrice comme la polyacrylamide est plus inerte et va donc avoir moins d’affinitĂ© avec les protĂ©ines et par le fait mĂŞme permettre une meilleure sĂ©paration qu’avec le gel d’agarose[1].   

D’autres matrices qui sont parfois utilisĂ©es pour la focalisation isoĂ©lectrique sont le papier, qui n’est plus vraiment utilisĂ© de nos jours, l’acĂ©tate de cellulose et l’amidon. Pour le papier, qui contient des molĂ©cules de cellulose, il sert Ă  sĂ©parer les acides aminĂ©s et d’autres petites molĂ©cules chargĂ©es. Lorsque l’on sĂ©pare des acides aminĂ©s avec le papier, cela doit cependant ĂŞtre fait Ă  très haut voltage. L’acĂ©tate de cellulose est surtout utilisĂ© afin de sĂ©parer des protĂ©ines sans grande rĂ©solution. Sa faible rĂ©solution permet seulement de sĂ©parer de grands groupes de protĂ©ines. Bien que l’acĂ©tate de cellulose ne soit pas dispendieux et facile d’emploi, il est beaucoup moins utilisĂ© que l’agarose. Finalement, les gels d’amidons, qui ne sont plus vraiment utilisĂ©s, sont poreux et servent Ă©galement Ă  la sĂ©paration des protĂ©ines[5].

Tampon

Le tampon à l’anode est un acide fort et celui à la cathode est une base forte. Ceux-ci sont souvent de l’acide phosphorique et de la triéthanoamine[9].

Ampholytes

Comme il a été mentionné précédemment, il faut utiliser des ampholytes pour créer un gradient de pH. Ceux-ci sont un mélange de polyélectrolytes de petites masses molaires. Le choix des différents ampholytes permet de créer des gradients de pH variés selon leur point isoélectrique adapté de façon spécifique à la séparation désirée. En effet, il est alors possible d’avoir des écarts de pH plus restreints d’une amplitude aussi petite que 0,1 unité pour mieux différencier les protéines qui ont des points isoélectriques près les uns des autres, afin augmenter la précision de la séparation. De plus, pour faire une analyse avec des protéines avec des points isoélectriques variées, il est possible de créer un gradient sur une plus vaste gamme de pH avec des intervalles de 2 à 10 et une séparation de 0,4 unité de pH au lieu de 0,1. Dans certains, il même possible d’obtenir une séparation de protéines ayant une différence de point isoélectrique aussi petite que 0,001 unités de pH[10].

Il existe deux façons d’introduire les protĂ©ines. En effet, il est possible de les introduire après la mise en place du gradient de pH avec les ampholytes aussi bien qu’avant. Ceci est possible, car les protĂ©ines sont plus grosses que les ampholytes. Les protĂ©ines ont donc un processus de migration nĂ©cessairement plus lent que les ampholytes, leur laissant amplement de temps pour se stabiliser afin de crĂ©er le gradient de pH[10].

Cellule d'électrophorèse

Pour effectuer une focalisation isoélectrique sur des analytes, il est nécessaire d’avoir une cellule d’électrophorèse avec une anode et une cathode pour introduire un courant électrique permettant d’établir un gradient de pH dans le gel de polyacrylamide.

Il est à noter que, même si la focalisation isoélectrique ressemble beaucoup à l’électrophorèse, celle-ci comporte plusieurs avantages. Premièrement, le temps de focalisation est différent dans une focalisation isoélectrique par rapport à une électrophorèse normale. Avec la focalisation isoélectrique, le temps de focalisation est moins critique, puisque les protéines ne peuvent pas sortir du gel, car elles s’arrêtent au pH où elles auront atteint leur point isoélectrique. Il faut donc que la migration dure suffisamment longtemps pour permettre aux ampholytes de bien se placer correctement pour créer un gradient immobile et que les protéines aient le temps de se rendre à leur point isoélectrique, mais il n’est pas nécessaire de craindre la perte des analytes[11].

Matériel pour la détermination du pH

Il est possible de dĂ©terminer le pH du point isoĂ©lectrique des protĂ©ines en comparant la distance de migration avec celle de protĂ©ines pures oĂą le point isoĂ©lectrique est connu. Aussi, l’utilisation d’une microĂ©lectrode de surface peut permettre de  dĂ©terminer le pH oĂą une protĂ©ine s’est immobilisĂ©e. [11]

Préparation des protéines

Pour la focalisation isoélectrique, on peut focaliser les protéines sous leur forme dénaturée ou à leur état natif. C’est à leur état natif que les protéines sont le plus souvent étudiées puisqu’à cet état, on peut retrouver plusieurs formes différentes de la protéine tandis qu’avec la forme dénaturée, on va seulement voir une bande sur le gel. Les protéines peuvent être dénaturées en les traitant avec de l’urée ou un agent réducteur de thiol, par exemple la dithiothréitol (DTT), ce qui va changer la protéine en polypeptide et va également augmenter drastiquement la solubilité des protéines hydrophobes. Donc, ce sont surtout les protéines qui sont hydrophobes qui vont être dénaturées avant d’être focalisées. Lorsque les protéines sont dénaturées, on doit ajouter de l’urée dans le gel également et dans ces conditions, la température du gel devrait être de 20 °C afin d’éviter la formation d’isocyanate provenant de l’urée, ce qui influencerait les résultats de l’analyse[5].

Marqueurs

Après avoir fini la séparation des protéines par leur pI, il est important de pouvoir observer les bandes qui ont été formées. Pour ce faire, il existe quelques méthodes qui permettent de les voir. La première est la coloration avec divers colorants comme le bleu de Coomassie où l’on doit fixer le gel avec 20 % d’acide trichloroacétique, ensuite colorer le gel avec le bleu de Coomassie dissout dans 40 % de méthanol et 10 % d’acide acétique puis faire une décoloration avec 25 % de méthanol et 10 % d’acide acétique. Le colorant vert solide FCF est un colorant qui n’interfère pas avec les ampholytes que l’on retrouve dans le gel de focalisation isoélectrique, et il fournit une meilleure plage de détection que le bleue de Coomassie[5].

On peut également utiliser un colorant fluorescent, comme le fluorescamine, qui va se lier avec les groupements amines primaires des peptides et former des composés très fluorescents. Cependant cette méthode nécessite un appareil qui va permettre de voir le colorant. Il existe aussi plusieurs méthodes de coloration à l’argent qui peuvent être utilisées. Pour les enzymes, la technique qui peut être utilisée est la détection par zymographie. La technique de coloration va dépendre du type de matrice utilisé et également des molécules étudiées[6].

À ce jour, les marqueurs de type fluorescent qui émettent des longueurs d’onde différentes sont en plein essor[12].

Combinaison avec d'autres méthodes de séparation

Figure 2. Dans cette figure, on peut observer en 1) la première étape pour l’électrophorèse bidimensionnelle, la focalisation isoélectrique. À cette étape, les protéines migrent jusqu’à leur point isoélectrique puis restent au pH correspondant au pI dans le gel. Par la suite, en 2) une petite bande du gel de la focalisation isoélectrique est prise et un gel SDS est fait à partir de la bande, obtenue à la première étape, comme puits de départ. Lors de l’électrophorèse dénaturante, les protéines qui ont été séparées selon leur pI sont maintenant également séparées par leur poids moléculaire, ce qui permet une meilleure analyse des protéines. Le schéma est inspiré d’une image qui provient du site suivant : http://biochimiedesproteines.espaceweb.usherbrooke.ca/5b1.html.

Électrophorèse bidimensionnelle

Afin d’étudier un grand nombre de protĂ©ines en mĂŞme temps, la focalisation isoĂ©lectrique est souvent combinĂ©e Ă  une Ă©lectrophorèse dĂ©naturante (gel de SDS), qui sĂ©pare les molĂ©cules selon leur poids molĂ©culaire. Cette technique, l’électrophorèse bidimensionnelle (gel 2D) a Ă©tĂ© introduite par Patrick H. O’Farrell en 1975 et devrait permettre d’analyser au maximum 5 000 protĂ©ines[13]. L’utilisation de ces deux techniques de sĂ©parations permet une grande rĂ©solution puisque le pI et le poids molĂ©culaire d’une molĂ©cule ne dĂ©pendent pas l’un de l’autre. La première dimension du gel 2D est toujours la focalisation isoĂ©lectrique et par la suite le gel de SDS[14].

Autres combinaisons

La focalisation isoélectrique peut être combinée à d’autres méthodes de séparations que le gel de SDS qui sépare les molécules en fonction de leurs poids moléculaire. La plupart de ces autres méthodes séparent également les protéines en fonction de leurs tailles ou poids moléculaires.

Par exemple, on peut combiner le gel de focalisation isoélectrique avec un gel d’acétate de cellulose ou un gel d’électrophorèse avec un gradient de pore. Ce dernier gel permet de séparer les protéines dans leurs états natifs en fonction de leur taille moléculaire avec l’aide d’un gel dans lequel la taille des pores diminue graduellement grâce à une augmentation de la concentration du gel[14].

Finalement, la focalisation isoélectrique peut être combinée à l’immunoélectrophorèse. Cette combinaison est surtout utilisée en immunologie et consiste à prendre une bande du gel obtenue avec la focalisation isoélectrique et à la placer dans un gel qui contient une solution d’anticorps spécifiques, ce qui va faire migrer les protéines selon l’affinité des antigènes avec ces anticorps. Cette technique a été utilisée pour l’analyse de protéines urinaires, des amylases salivaires et des protéines sériques humaines[14].

Applications

La focalisation isoĂ©lectrique est utilisĂ©e pour des analyses en clinique par exemple afin de dĂ©terminer la sĂ©vĂ©ritĂ© du diabète chez une personne en dĂ©terminant la variation des charges de l’hĂ©moglobine due Ă  des modifications aux groupements amines. Elle permet aussi l’analyse de nourriture ou de graines. Elle est surtout utilisĂ©e pour les applications suivantes : la sĂ©paration des protĂ©ines en fonction de leur pI, le contrĂ´le alimentaire, soit savoir s’il y a des traces animales, permet de faire la diffĂ©renciation de casĂ©ines, des protĂ©ines que l’on retrouve dans les produits laitiers, la caractĂ©risation de certaines espèces de plantes comme le blĂ© et finalement, elle est utilisĂ©e pour des analyses de routine en clinique entre autres pour l’a-amylase ou pour l’identification des diffĂ©rentes isoenzymes de l’alcool dĂ©shydrogĂ©nase[6] - [15].    

Avantages et inconvénients

La focalisation isoélectrique comporte plusieurs avantages en comparaison avec d’autres méthodes d’électrophorèse.

Premièrement, la focalisation isoélectrique permet d’avoir un plus grand nombre d’échantillons qui sont étudiés sur le même gel sans diminuer la résolution des résultats. Afin d’avoir une meilleure résolution dans d’autres méthodes, il est important d’avoir seulement un petit échantillon. La focalisation isoélectrique ne nécessite pas la dénaturation des protéines, donc pour la suite de l’analyse des résultats, la coloration ou la détection d'anticorps n’est pas gênée par la dénaturation[6].

Si l’on compare la focalisation isoĂ©lectrique avec des mĂ©thodes qui ont des applications semblables, par exemple la rĂ©action en chaine par polymĂ©rase (PCR), elle est plus efficace, a une meilleure expression, est plus Ă©conomique, facile Ă  rĂ©aliser et Ă  analyser. Elle a l’avantage de contrer la diffusion da la molĂ©cule hors de son pI puisque lorsque la molĂ©cule se retrouve dans une zone qui n’es pas son pI, elle va ĂŞtre chargĂ©e et va donc migrer dans sa zone de pI grâce au champ Ă©lectrique. Cependant, elle peut ĂŞtre difficile Ă  reproduire, le temps d’analyse est long et ce n’est pas une technique facile Ă  automatiser[6].    

Notes et références

  1. (en) Garfin D., Ahuja S., Handbook of isoelectric Focusing and Proteomics, First Edition, Californie, Academic Press, , 334 p.
  2. Skkog D. A., WestD. M., Holler F. J., Crouch S. R., Principes d'Analyse instrumentale, Bruxelles, Belgique, Groupe De Boeck, , 957 p.
  3. (en) Luner, S. J., & Kolin, A., « A New Approach to Isoelectric Focusing and Fractionation of Proteins in a pH Gradient », Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,‎
  4. Skoog D. A., WestD. M., Holler F. J., Crouch S. R., Chimie Analytique, Bruxelles, Belgique, Groupe DE Boeck, , 1116 p.
  5. Voet D., Voet J.G., Biochimie, Bruxelles, Belgique, Groupe De Boeck, , 1585 p.
  6. (en) « Isoelectric focusing », sur sigmaaldrich.com
  7. Lodish, Berk, Matsudaira, Kraiser, Kreger, Scott, Zipursky, Darnell, Biologie moléculaire de la cellule, Bruxelles, Belgique, Groupe De Boeck,
  8. « Fiche complète pour Acrylamide - CNESST », sur www.csst.qc.ca (consulté le )
  9. (en) 8 Boyer, R.F., Modern Experimental Biochemistry, USA, Addison-Wesley Publishing Company, , 132 p.
  10. (en) Lata G.F., Dryer. R.L., Experimental Biochemistry, New York, Oxford University Press, , 514 p.
  11. (en) Plummer D.T., An introduction to practical biochemistry (3e Ă©dition), Londres, Angleterre, McGraw Hill Book Co., , 332 p.
  12. Durand G., Beaudeux J., Biochimie médicale : marqueurs actuels et perspectives, Paris, France, Éditions Lavoisier, , 607 p.
  13. (en) Patrick H. O'Farrell, « High resolution two-demensional electrophoresis of proteins », J Biol Chemestry,‎ (lire en ligne)
  14. (en) Nicholas Catsimpoolas, Isoelectric focusing, New York, Academic Press Inc, , 265 p. (ISBN 0-12-163950-9)
  15. (en) John A. Duley, Owen Harris et Roger S. Holmes, « Analysis of Human Alcohol- and Aldehyde-Metabolizing Isozymes by Electrophoresis and Isoelectric Focusing », Alcoholism: Clinical and Experimental Research, vol. 9,‎ , p. 263–271 (ISSN 1530-0277, DOI 10.1111/j.1530-0277.1985.tb05747.x, lire en ligne, consulté le )


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