Chromatographie préparative

Lorsque seulement quelques milligrammes d'un composé purifié sont récupérés, la masse de l'échantillon peut être augmentée jusqu'au point où les pics chromatographiques voisins se chevauchent. Ce type de séparation, mieux connu sous son appellation anglaise touching-peak separation (ou T-P separation), correspond à la quantité maximale d'échantillon pouvant être injectée en tête de colonne tout en permettant la récupération d'environ 100 % du produit désiré pur à presque 100 %[8].

Pour la séparation d'échantillons lourds (de masse >>10 mg) deux options s'imposent : l'utilisation de colonnes à diamètre plus large et l'optimisation des conditions pour une résolution maximale du pic chromatographique du produit souhaité[9].

Il est possible de séparer un échantillon en augmentant le diamètre de la colonne et obtenir les mêmes résultats si les conditions expérimentales sont connues et maintenues (longueur de la colonne, phase mobile, phase stationnaire). Le volume d'échantillon et son débit sont augmentés proportionnellement à la surface transversale de la colonne[9]. Ces derniers paramètres doivent être augmentés d'un même facteur pour que la séparation demeure la même autant lors de l'utilisation d'une colonne de petit diamètre, que lors de l'utilisation d'une colonne de large diamètre[9]. À ce moment, les temps de rétention, la largeur des pics, la résolution et la pression dans la colonne demeurent constants[9].

Figure 4 a) Conditions de séparation prep-LC optimisée pour la purification du pic chromatographique du produit (8); b)Séparation de type T-P (gros échantillon) d'après les conditions de prep-LC utilisées en a).

Un échantillon lourd peut aussi être mieux séparé en améliorant la sélectivité. En chromatographie préparative, la récupération d'un seul produit (d'un seul pic) est fréquente. Dès lors, seulement la résolution entre le pic du produit recherché et les pics d'impuretés adjacents est importante[9]. La résolution du pic du produit est alors de préférence la plus élevée possible. La sélectivité peut être améliorée en changeant les conditions de séparation[9].

La capacité des colonnes correspond à l'absorption d'une molécule en solution ou, en d'autres mots, à la quantité maximale d'analytes qui remplira entièrement une monocouche absorbée. Cette capacité est spécifique à chaque colonne et varie en fonction des conditions expérimentales et des analytes. Elle est en effet proportionnelle à la surface accessible de phase stationnaire et influencée par la nature des molécules dans l'échantillon[11]. Il faut aussi prendre en considération la dimension des pores du matériau de remplissage. Des petits pores rendent difficile la rétention de grosses molécules et diminuent la capacité des colonnes. À l'opposé, de grands pores diminuent la surface disponible à l'adsorption et diminuent la capacité de la colonne par le fait même. Des pores de grosseur intermédiaire sont alors un bon compromis et procurent une meilleure capacité de colonne[11]. De plus, il faut considérer les caractéristiques des molécules à séparer[11]. Par exemple, de petites molécules qui s'adsorbent perpendiculairement à la phase stationnaire augmentent la capacité de la colonne alors que les molécules chargées (ions) qui se repoussent par interactions électrostatiques lorsqu'elles sont adsorbées la diminuent[11].

Figure 5 Effets d'une surcharge de volume sur la séparation de deux pics voisins

Le volume de l'échantillon injecté dépend de la masse de produit voulue et sa concentration dans cet échantillon. Cependant, le volume d'échantillon introduit n'a que peu d'effet en chromatographie préparative jusqu'à ce qu'il atteigne la moitié du volume du pic du produit recueilli[12].

La quantité d’échantillon introduite pour la séparation dépend aussi de la solubilité de ce dernier dans la phase mobile. Un certain poids de l’échantillon doit être injecté pour qu’une séparation T-P puisse avoir lieu[11]. Le solvant et la température jouent sur cette solubilité.

Le solvant dans lequel est dissout l’échantillon influence sa solubilité et sa séparation. Il faut alors savoir choisir un solvant permettant un compromis satisfaisant entre la solubilité de l’échantillon dans la phase mobile et la sélectivité de la colonne. En général, un solvant de force similaire à la phase mobile est choisi pour éviter des effets indésirables lors de la séparation[11].

Une augmentation de la température de la colonne augmente aussi généralement la solubilité de l’échantillon. Cela a aussi pour effet de diminuer la rétention des analytes et la quantité pouvant être injectée[13].

En chromatographie, on peut définir la résolution comme étant la capacité de deux substances à sortir séparément sur le chromatogramme[16]. Visuellement, c’est l’écart entre deux signaux (entre deux pics) sur le chromatogramme [16]. La résolution varie alors de la façon suivante[16] :

$${\displaystyle R_{s}={\frac {V_{1}-V_{2}}{{\tfrac {1}{2}}(W_{1}+W_{2})}}}$$

où Rs=Résolution, V1 et V2: Volume d'élution et W1 et W2=Largeur des pics

Le volume de rétention dépend de la sélectivité de la substance et la largeur des pics dépend de l’efficacité de la colonne [16]. En pratique, toutefois, on délaisse la résolution comme paramètre au profit du facteur de purification[16] .

Le premier facteur influençant la résolution est l’efficacité (N) liée au nombre de paliers théoriques de la colonne[17]. Un plateau théorique est une zone fictive à l’intérieur de laquelle la distribution des analytes entre les phases mobile et stationnaire atteignent un équilibre [3]. La qualité du lit de gel choisi lors d’une chromatographie préparative est important et correspond au diamètre des particules qui le composent[17]. Aussi, l’efficacité repose sur la longueur de la colonne [17]. Plus la colonne qui effectue la chromatographie est longue, plus il y a de paliers théoriques, et plus la chromatographie est efficace[17] . La largeur des pics peut être optimisée en fonction de l’efficacité selon l’équation suivante : 

$${\displaystyle N=16\left({\frac {V_{e}}{W}}\right)^{2}}$$

où N=Efficacité, Ve: Volume d'élution et W=Largeur des pics

On peut alors comprendre pourquoi la largeur des pics diminue si l’efficacité augmente. En se reportant à l’équation de la résolution, on peut alors déduire que la résolution augmente en fonction de l’efficacité. Les pics sur le chromatogramme seront alors plus minces. Il faut toutefois préciser que ce paramètre joue un rôle minime en comparaison à la sélectivité[17] .

Le deuxième facteur influençant la résolution est la sélectivité[16]. Celui-ci influence la résolution du chromatogramme plus que tout autre paramètre[16] . En augmentant la sélectivité, la distance entre les pics augmente [16]. Ainsi, selon la définition de la résolution indiquée plus haut, plus la sélectivité est grande, plus la résolution est grande. En chromatographie préparative, à l’exception de certains cas plus complexes, on s’attarde plus à la sélectivité qu’à la résolution puisque le but n’est pas d’analyser mais de séparer les différents constituants en augmentant leur rendement[14] .

À l’instar de l’efficacité, le débit de la colonne est augmenté en jouant avec les dimensions de la colonne, seulement ici, en changeant son rayon[17]. En effet, comme le débit correspond au rayon au carré, lorsque ce dernier augmente, le débit augmente aussi. Pour l’optimiser, il faut faire varier la vitesse d’écoulement. [17]

Aussi, la phase stationnaire utilisée lors de la chromatographie doit promouvoir le meilleur ratio entre vitesse d’écoulement et chargement de la colonne [18]. Afin d’optimiser la technique, il faut alors adapter les conditions expérimentales à la phase stationnaire choisie puisqu’elles lui sont propres [19]. Par exemple, il est possible de modifier le pH et la force ionique d’une phase stationnaire pour optimiser le débit, mais il n’est pas dit que ces ajustements seront valables pour une autre phase stationnaire. Il faudra alors refaire l’optimisation en fonction de cette dernière[19] .

Lorsqu’on pense à la chromatographie préparative, il faut garder en tête que celle-ci s’applique à presque toutes les techniques de chromatographies analytiques (chromatographie liquide haute performance (HPLC), chromatographique liquide-solide (LSC), chromatographie à échange d’ions (IC), chromatographique gaz-liquide (GLC), etc.). Le choix de la méthode utilisée doit être fait en fonction des analytes à séparer. Par exemple, la chromatographie d’échange d’ions (CI) peut être utilisée pour la séparation des ions et des composés polaires comme des acides et des bases[26]. Rappelons que le but principal de ces techniques est de séparer, de détecter et de purifier les substances étudiées.

Plusieurs montages et différents instruments peuvent être utilisés en fonction des différentes techniques de chromatographie. Comme la technique préparative se veut surtout qualitative, des détecteurs non destructifs sont utilisés. Les analytes de l’échantillon peuvent alors être recueillis intacts. L’une des plus utilisées est la chromatographie liquide haute performance préparatoire (Prep-HPLC). La figure 6 montre un exemple de cette technique.

Figure 6 Exemple d’un montage de prep-HPLC

Généralement l’équipement de la HPLC est automatisé : l’injecteur et le collecteur de fraction, par exemple, peuvent être automatiques[27]. La taille de ce type de système de séparation et les différentes conditions dépendent principalement de la taille de la colonne. Ce raisonnement est aussi applicable pour les autres types de montages. Par exemple, il existe des colonnes de 2 à 5 cm pour lesquelles on utilise des débits de 18 à 120 mL/min[27]. De plus, les pompes doivent être ajustées selon les colonnes pour appliquer une pression raisonnable sans affecter leur performance tout en ajoutant un volume qui les surcharge. Aussi, la taille des particules idéale devrait se situer entre 5 et 20 mm pour ce type de montage[28]. Dans ce dernier, on crée deux gradients de solvants. Dans la figure 5, une HPLC préparatoire à deux solvants est illustrée. En premier lieu, on enlève l’oxygène à l’aide du dégazeur dans les deux solvants et on les pompe ensuite avec une pompe haute pression vers un mixeur qui mélange les deux solvants pour ensuite les diriger vers la colonne. Par la suite, l’échantillon est injecté à l’aide d’un injecteur simple et est envoyé dans la colonne séparatrice à l’aide d’une vanne de commutation. L’échantillon arrive finalement au détecteur et au collecteur de fractions. Ce dernier sera en mesure d’identifier la fraction désirée et de la placer dans l’un des flacons du montage. Les fractions indésirables pourront être éliminées.