ChIP-Seq

Le séquençage par synthèse est utilisé par la plateforme Illumina. Cette technique est basée sur l’utilisation de quatre dideoxynucleotide triphosphates (ddNTP) terminateurs marqués par un fluorochrome différent. La lecture de la plaque est réalisée après excitation par un laser. Une courte séquence est obtenue pour chaque fragment après plusieurs cycles d’addition des ddNTPs et, est localisée sur la séquence génomique afin de permettre l’identification du site de liaison de la protéine[2].

La méthode de séquençage par ligation repose quant à elle sur l’hybridation spécifique par une ligase de courtes sondes oligonucléotidiques, marquées par un fluorochrome à chaque paire de base ou par couple de paires de bases, comme c’est le cas pour la plateforme SOLiD (Applied Biosystems), à une séquence ancrée à une séquence connue. L’avantage de cette technique réside en un très faible nombre de mismatches du à la forte spécificité de la ligase lors de l’hybridation, du fait de la double lecture des tags[3].

Enfin, la technique de pyroséquençage est basée sur la méthode de séquençage par synthèse, à la différence que dans ce cas seule la polymérase est marquée, où l’activité de polymérisation, en ajoutant une base déterminée à chaque fragment de séquence capturé sur des millions de billes, produit une fluorescence détectable par stimulation au laser. Un atout majeur de cette technique est la taille des fragments séquencés, de l’ordre de 300 à 500 pb, comparé à un ordre de 25 à 90 pb dans le cas des séquençages par synthèse et par ligature[4].

Cette technique est utilisée par les séquenceurs de type HeliScope. Le principal avantage de cette technique est la possibilité de séquencer sans amplification préalable[3] - [5].

Cette prouesse est permise par imagerie des nucléotides fluorescents à l’échelle moléculaire, rendant donc l’amplification clonale optionnelle. Le principe de séquençage repose sur le séquençage par synthèse. Ce système a permis le séquençage, par exemple, d’une seule molécule d’ADN viral[5].

Cette étape est cruciale car elle permet l’assignation d’un read à une position chromosomique sur un génome de référence. Les techniques à haut débit présentent cependant le désavantage que la fiabilité de séquençage décroît beaucoup plus vite que lors du séquençage classique, avec lequel on peut séquencer en toute confiance jusqu’à 600pb. La fiabilité de lecture du séquençage à haut débit varie selon la technique utilisée, mais dans le cas du séquençage par synthèse et par ligation, sur une longueur typique de 25pb séquencées, la fiabilité est de 90%, ce qui résulte en un nombre moyen de 2.5 mismatches pour des tags de 25 pb. De plus, les tags alignés peuvent correspondre à des régions répétées du génome, dont la position ne peut être estimée avec confiance.

Le cas échéant, ces tags sont donc considérés comme non alignés. L’alignement est donc paramétré selon ces considérations, on permet en général une occurrence de 2 mismatches sur 25pb[6]. Ces paramètres résultent en général en l’alignement d’environ 60-80% des reads[3]. Plusieurs programmes d’alignement sont utilisés à cet effet : dans le cas d’Illumina, le logiciel Eland est fourni, de même que AppliedAligner dans le cas de séquençage SOLiD. Un logiciel open source existe néanmoins, la suite Bowtie[7].

Sachant qu’il existe un décalage de la position des reads entre les brins Crick et Watson correspondant à la taille des fragments immunoprécipités, une technique simple consiste en un décalage des reads de la moitié de cette taille en 3’ pour chaque brin. Le résultat est alors un chevauchement des reads. Cette technique est utilisée par de nombreux logiciels, notamment Cisgenome [8] et ChIP-peak (ainsi qu’une méthode développée par Chen et al[9]. ainsi que d’autres revus par Pepke et al, et Wilbannks et al. [10] - [11] Cette technique simple est bien adaptée aux facteurs de transcription, puisque dans ce cas le maximum du pic est la région d’intérêt. Cependant elle n’est pas optimisée puisqu’en réalité, le maximum du pic devrait être représenté par un chevauchement de plus de séquences, les tags ne correspondant qu’aux extrémités 5’ des fragments séquencés. Elle est en outre incorrecte dans le ChIP réalisé sur des modifications d’histones, ou encore dans le cas de MNase, puisque dans ces conditions on s’attend à une longueur de fragment de 147pb, ce qui n’est pas reflété par ce traitement. Il est donc nécessaire dans ces exemples de procéder à une étape d’élongation.

Cette technique consiste à ramener les tags à la longueur réelle des fragments immunoprécipités. En général, la coupure sur gel est approximative, et ce même avec la meilleure précision, et génère donc des fragments de taille hétérogène dans une fenêtre de taille dépendant de la précision de la coupure. De plus, la sonication résulte en une hétérogénéité des tailles des fragments. On peut cependant estimer que l’hétérogénéité globale suivra une loi normale, et donc élonguer les fragments de la taille de coupure sur gel moins la taille des adaptateurs (91pb chez Illumina) avec une confiance relative. Cette méthode est utilisée par un nombre croissant de suites de traitement des données ChIP-Seq, dont FindPeaks [12] et Useq[13]. L’optimisation de cette étape est l’estimation de la taille des fragments in silico. Elle est très simple dans le cas du PET, puisque les extrémités 5’ des reads seront alors séparées de la taille d’un fragment donné[12]. Dans le cas contraire, elle peut cependant être estimée par une élongation itérative des tags et une estimation du chevauchement correspondant à chaque itération. Cette étape doit toutefois être effectuée chromosome par chromosome, les bruits de fond moyens variant d’un chromosome à l’autre pour une raison encore inexpliquée. La taille d’élongation à effectuer correspond alors à la moyenne des tailles estimées in silico par chromosome. L’algorithme MACS [14] fonctionne de manière similaire, en détectant le décalage moyen entre les brins positifs et négatifs, effectuant une extension des tags d'une taille correspondant à la longueur des fragments déterminée in silico.

On distingue deux types d’artéfacts : ceux liés au séquençage, ainsi ceux liés à un biais dans la quantité d’ADN extrait à un endroit donné, ce dernier pouvant être dû à des répétitions non caractérisées, ou à des duplications/répétitions d’éléments propres à un individu ou une variété. Ce dernier phénomène est particulièrement exacerbé dans le cas de lignées cellulaires. Une étape de suppression des artéfacts est préférable à une correction Log₂ ratio ChIP/Input. L'algorithme MACS estime également le nombre de tags permis par coordonnée génomique donnée par le biais d'une loi binomiale, supprimant ainsi les artéfacts du a une amplification clonale des reads lors de la préparation des librairies de séquençage.

Ce traitement est nécessaire avant toute méta-analyse, car seules les coordonnées contenant des profondeurs de lecture non nulles sont obtenues, et n’incluent donc pas les régions non séquencées, qui sont donc considérées comme non enrichies, aussi bien dans l’Input que dans le ChIP. Le fenêtrage, ou binning, s’effectue par la division des coordonnées chromosomiques en intervalles réguliers de k pb. Le nombre de fragments commençant, chevauchant ou finissant dans un intervalle donné est compté et ramené à k pb, ce qui résulte en une valeur moyenne par pb sur chaque intervalle.

La relation entre les signaux ChIP et Input n’est pas linéaire. Une normalisation par la médiane ne peut donc pas être effectuée. De plus, une normalisation lowess n’est pas pratique dans ce cas au vu du nombre même des signaux à prendre en compte. Une solution consiste donc en l’estimation des signaux moyens Input sur un intervalle de k pb, alors retranchés au signal ChIP.

Il est à noter que la normalisation via le ratio du nombre total de lectures entre deux profils est couramment utilisée mais comporte des biais notamment lorsqu'il y a une grande différence entre le rapport signal/bruit entre ces deux profils. Il existe un algorithme prenant en compte ces paramètres. Dans un premier temps, les régions à faible densité ne sont pas considérées, puis un rapport de normalisation est calculé pour chaque profil et chacune des régions restantes. Enfin, les valeurs médianes des ratios sont utilisés en tant que facteurs de normalisation. De cette façon, une estimation robuste et relativement impartiale peut être utilisé pour la normalisation[15].

Ce processus utilise un principe analogue à celui utilisé en ChIP-chip. Certains algorithmes, comme MACS [14] ou ChIP-peak, optimisés pour le traitement de données ChIP-Seq issues d’études portant aux facteurs de transcription, estiment un pic par le calcul du chevauchement maximum des tags décalés, selon un score minimum significatif défini[6].

Cette approche est intéressante car rapide, et permet d’isoler les maxima locaux, qui correspondent souvent, mais pas toujours[16], au site de fixation du facteur de transcription recherché. La suite Useq effectue la recherche de pics de manière analogue, mais à la suite de l’élongation des tags.