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Centrifugation analytique

La centrifugation analytique est une mĂ©thode d’analyse des suspensions et Ă©mulsions donnant des informations sur leur granulomĂ©trie, masse, leur taille, leur forme et leur composition. Plusieurs types d’expĂ©riences existent : la stabilitĂ©, la vitesse de sĂ©dimentation et l’équilibre de sĂ©dimentation.

Instrumentation

Lors de la centrifugation, on mesure à une longueur d'onde donnée l'absorbance de l'échantillon en fonction de la distance à l'axe de rotation. On obtient donc la répartition du matériel dispersé (par mesure de densité optique) dans la cellule de centrifugation en fonction de toute la longueur de l'échantillon (distance radiale) et du temps.

On utilise le fractionnement des particules ou gouttelettes dispersĂ©es dans un liquide porteur (phase continue) selon leur diffĂ©rences de taille et de densitĂ© comme le dĂ©crit la loi de Stokes. La valeur de g est variable et est calculĂ©e Ă  partir de la vitesse angulaire de centrifugation, la masse de l'Ă©chantillon et la distance par rapport au centre de rotation. Cette technique est sĂ©parative, la centrifugation permet le fractionnement des particules et un dispositif optique permet de quantifier les diffĂ©rentes fractions. On recommande cette approche pour la rĂ©solution de systĂšmes polydispersĂ©s multimodaux. Chaque fraction sĂ©parĂ©e peut ĂȘtre analysĂ©e indĂ©pendamment des autres populations prĂ©sentes dans l'Ă©chantillon. La centrifugation analytique permet d'accĂ©lĂ©rer la migration des nanoparticules ou nano-objets et de dĂ©caler jusque 10 nm la limite infĂ©rieure de quantification.

Vitesse de sédimentation

Dispersions et Ă©mulsions

La suspension ou l'Ă©mulsion Ă  analyser est insĂ©rĂ©e sans aucune dilution prĂ©alable Ă  l’intĂ©rieur d’un contenant transparent et est traversĂ©e par un rayonnement lumineux (visible, X, IR...). L'intĂ©rĂȘt majeur de cette technique est qu'elle permet d'obtenir une distribution de granulomĂ©trie indĂ©pendante des propriĂ©tĂ©s optiques des matĂ©riaux dispersĂ©s. On monitore lors de la centrifugation les changements de densitĂ© optique dus aux dĂ©placement des fractions pour en dĂ©terminer la vitesse de migration et on obtient une distribution granulomĂ©trique pondĂ©rĂ©e par la vitesse de migration des objets. Cette distribution peut ĂȘtre convertie en intensitĂ©, masse ou volume, il faudra alors indiquer la densitĂ© des particules et la viscositĂ© du liquide porteur pour rĂ©soudre l'Ă©quation de Stokes et isoler le diamĂštre sphĂ©rique Ă©quivalent [1] - [2].

Macromolécules

Lorsque l'on centrifuge une macromolĂ©cule avec une grande vitesse angulaire (par rapport Ă  sa capacitĂ© Ă  sĂ©dimenter), la macromolĂ©cule est entraĂźnĂ©e vers l'extĂ©rieur, elle culotte. Durant l'expĂ©rience, on observe Ă  diffĂ©rents temps l’absorbance en fonction de la distance Ă  l'axe de rotation: un front se forme et se dĂ©place vers le fond de la cellule.

La position de ce front en fonction du temps permet de calculer le coefficient de sĂ©dimentation, s, caractĂ©risant la particule dans son milieu. s est le rapport entre vitesse de la particule (v) et accĂ©lĂ©ration due Ă  la force centrifuge (, oĂč est la vitesse angulaire et r' la distance Ă  l'axe de rotation). Dans le cas d'un systĂšme interagissant, on peut obtenir un ou plusieurs fronts. Les coefficients de sĂ©dimentation mesurĂ©s correspondent, dans le premier cas, Ă  la moyenne en poids des coefficients de sĂ©dimentation des espĂšces individuelles, et leurs valeurs dĂ©pendront non seulement des caractĂ©ristiques des espĂšces individuelles et de leur constante d'association, mais aussi des vitesses relatives d'association et de sĂ©paration d’espĂšces.

Équation

Le coefficient de sédimentation s est exprimé en Svedberg, par la relation suivante (pour un soluté homogÚne, idéal dans un solvant) :

La valeur du coefficient de sĂ©dimentation va dĂ©pendre du poids molĂ©culaire M de la macromolĂ©cule, mais aussi du terme qui exprime la diffĂ©rence de densitĂ© entre la macromolĂ©cule et le solvant, puisque est la densitĂ© du solvant et le volume partiel spĂ©cifique de la macromolĂ©cule, soit l'inverse de sa densitĂ© ; s dĂ©pend aussi du nombre d’Avogadro N, du coefficient de friction , donc de la forme de la macromolĂ©cule et de la viscositĂ© h du solvant. Les coefficients de sĂ©dimentation sont gĂ©nĂ©ralement exprimĂ©s corrigĂ©s par la viscositĂ© et la densitĂ© du solvant par , le coefficient qu'aurait la particule si la mesure avait Ă©tĂ© effectuĂ©e dans l'eau, Ă  20 °C. Le dĂ©pend nĂ©anmoins de trois paramĂštres macromolĂ©culaires, la masse, le volume partiel spĂ©cifique et la forme. Pour interprĂ©ter , le volume partiel spĂ©cifique de la protĂ©ine est calculĂ© Ă  partir de la composition en acides aminĂ©s de la protĂ©ine.

Dans le cas d’un Ă©chantillon homogĂšne sans interaction, l’analyse de l’élargissement du front permet d’obtenir , le coefficient de friction, et donc de calculer M, le poids molĂ©culaire.

IntĂ©rĂȘt de la technique

Les expĂ©riences de vitesse de sĂ©dimentation sont extrĂȘmement utiles car rapides (entre 1 et 3 heures) et visuelles, puisque l'on sĂ©pare les espĂšces. Elles permettent de dĂ©tecter des hĂ©tĂ©rogĂ©nĂ©itĂ©s, de mettre en Ă©vidence des phĂ©nomĂšnes de dissociation ou d'association, des tendances Ă  l’attraction ou Ă  la rĂ©pulsion, et dans certains cas de dĂ©terminer les poids molĂ©culaires.

L'intĂ©rĂȘt majeur de cette technique est qu'elle permet d'obtenir une distribution de granulomĂ©trie indĂ©pendante des propriĂ©tĂ©s optiques des matĂ©riaux dispersĂ©s. On monitore lors de la centrifugation les changements de densitĂ© optique dus aux dĂ©placement des fractions pour en dĂ©terminer la vitesse de migration et on obtient une distribution granulomĂ©trique pondĂ©rĂ©e par la vitesse de migration des objets. Cette distribution peut ĂȘtre convertie en intensitĂ©, masse ou volume, il faudra alors indiquer la densitĂ© des particules et la viscositĂ© du liquide porteur pour rĂ©soudre l'Ă©quation de Stokes et isoler le diamĂštre sphĂ©rique Ă©quivalent

Voir aussi

Références

  1. Particle size distribution by space or time dependent extinction profiles obtained by analytical centrifugation (concentrated systems)
  2. Transparent, colorless infrared radiation absorbing compositions comprising nanoparticles
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