Bio-brique

Une fondation dénommée "BioBricks Foundation" a été créée en 2006 par des ingénieurs et des scientifiques comme association à but non commercial avec l'objectif de normaliser les "pièces biologiques" utilisées ou utilisables par la biologie synthétique[8]. La Fondation se concentre sur la Technologie, le Droit, et l'Éducation au service de la biologie synthétique. La Fondation accueille aussi la SBx.0, un programme éducatif et technique qui cherche à se développer dans le monde entier. Ses programmes techniques visent la production d'une série de briques biologiques standard. En complément, des programmes visent une généralisation de l'enseignement de ces techniques et l'aide à l'émergence de sources ouvertes et normalisées de "pièces biologiques"[9].

Comme une alternative aux systèmes traditionnels de brevets biotechnologiques, et dans un effort de large mise à disposition de "briques biologiques" standardisées et utilisables par une communauté open-source, la Fondation a produit un accord dénommé "BioBricks Public Agreement" (BPA)[10]. Cet accord constitue un cadre légal permettant aux utilisateurs de faire reconnaître leur paternité d'invention lors de la réutilisation de bio-briques, de mentionner l'existence ou non de brevet sur des combinaisons de bio-briques, et de librement construire sur la base des contributions des autres utilisateurs, chacun s'engageant à ne revendiquer aucun droit de propriété sur les composants réutilisés[11] - [12].

Cette nouvelle norme, développé par Tom Knigh est la plus largement utilisée parmi les standard d'assemblage. Elle implique l'utilisation d'enzymes de restriction. Chaque Bio-brique est une séquence d'ADN qui est portée par un plasmide circulaire, lequel est utilisé comme vecteur[14]. Ce vecteur agit comme un système de transport pour déplacer la bio-brique. La première approche allant dans ce sens a été l'introduction de séquences standard, des séquences "préfixe" et "suffixe" respectivement aux extrémités 5' et 3' d'une séquence d'ADN[15]. Ces séquences standard encodent des sites spécifiques à l'enzyme de restriction. Le préfixe code les sites EcoRI (E) et Xbal (X), tandis que le suffixe code les sites SpeI (S) et PstI (P). Ces préfixe et suffixe ne sont pas considérés comme faisant partie de la bio-brique[3]. Pour faciliter le processus d'assemblage, les bio-briques elles-mêmes ne doivent pas contenir l'un de ces sites de restriction. Lors de l'assemblage de deux briques différentes, l'un des plasmides est digéré avec EcoRI et SpeI. Le plasmide portant l'autre bio-brique est digéré avec EcoRI et Xbal. Cela laisse deux plasmides avec 4 paires de base (pb) au niveau des extrémités 5’ et 3’. Les sites EcoRI vont le lier car ils sont complémentaires les uns des autres. Les sites Xbal et SpeI seront également liés car la "digestion" laissera des extrémités compatibles. Alors les deux briques de l'ADN se retrouvent dans un même plasmide. La ligature donne une zone « cicatricielle » de 8 paires de base entre les deux bio-briques. Comme le site de cette cicatrice est un hybride des sites Xbal et SpeI, il n'est pas reconnu par l'enzyme de restriction[15]. Les séquences préfixe et suffixe demeurent inchangées par ce processus de digestion et de « collage », ce qui permet de nouvelles étapes de montage avec plus de bio-briques.

Cette méthode d'assemblage est un processus idempotent : de multiples applications ne change pas le produit final, et maintiennent le préfixe et le suffixe. Cependant si l'assemblage de bio-briques standard permet la formation de modules fonctionnels, le standard 10 a des limites. Le site cicatriciel à 8 paires de bases (bp) ne permet pas la création d'une vraie protéine de fusion[14]. Le site-cicatrice cause un décalage ribosomique (aussi dénommé décalage du cadre de lecture) qui empêche la lecture en continu de codons, qui est nécessaire à la formation d'une protéine de fusion.

Tom Knight a ensuite (en 2008) développé un protocole (BB-2 assembly standard) pour répondre à ce problème, en utilisant d'autres enzymes pour la digestion de la première partie ; ce sont presque les mêmes mais avec des préfixes et suffixes modifiés[16].

Le "BglBrick assembly standard" est une autre norme, proposée par J. Christopher Anderson, John E. Dueber, Mariana Leguia, Gabriel C. Wu, Jonathan C. Goler, Adam P. Arkin, and Jay D. Keasling en septembre 2009. Il s'agit d'une méthode permettant de faire de multiples fusion de domaines protéiques de briques biologiques sans modifier le cadre de lecture ni introduire de codons stop. Cette méthode crée une cicatrice GGATCT pouvant ensuite être assemblée par une autre méthode[16].

Le Pam Silver lab a créé cet autre standard pour surmonter le problème de la formation d'une protéine de fusion. Ce standard d'assemblage est également connu sous le nom de Biofusion. Il s'agit d'une amélioration du ""BioBrick assembly standard 10"" ; il implique la suppression d'un nucléotide du site Xbal et SpeI, ce qui réduit la cicatrice de 2 nucléotides, permettant de maintenant former une séquence cicatricielle de 6 paires de base (bp) . Cette dernière permet au cadre de lecture d'être maintenu. La séquence cicatricielle code l'acide aminé thréonine (ACT) et l'arginine (AGA)[17]. Cette légère amélioration permet la formation d'une protéine de fusion dans le cadre. Cependant, l'arginine est un acide aminé chargé, ce qui est un désavantage pour les techniques d'assemblage Biofusion : ces propriétés de l'arginine induisent une déstabilisation de la protéine selon le principe "N-end rule".

Une équipe ayant participé à l'IGEM de 2007 [18] a introduit ce nouveau standard d'assemblage pour pallier les inconvénients de l'approche Biofusion.
Elle a créé un nouvel ensemble de séquences préfixes et suffixes en ajoutant des sites d'enzymes de restriction, AgeI et NgoMIV respectivement aux préfixe et suffixe existants. Ces sites d'enzyme de restriction nouvellement introduits sont compatibles avec les standards de bio-briques. Le standard de Fribourg produit encore un site cicatriciel de 6 bp, mais la cicatrice de la séquence (ACCGGC) code maintenant respectivement pour la thréonine et la glycine. Ceci aboutit à une protéine beaucoup plus stable[19] car la glycine forme une extrémité N-terminale (terminaison aminée) stable, à la différence de l'arginine qui induit une dégradation de cette même extrémité. 

La méthode 3A est la plus couramment utilisée, car compatible avec les méthodes citées ci-dessus.

Cette méthode de montage comporte deux bio-briques et un plasmide de destination. Ce dernier contient un gène toxique (létal), pour faciliter le choix d'un plasmide correctement assemblé. Le plasmide de destination a aussi un autre gène de résistance aux antibiotiques, différent de ceux des plasmides portant les bio-briques. Ces trois plasmides sont tous digérés grâce à l'enzyme de restriction appropriée et ils peuvent ensuite se ligaturer. Seuls les assemblages corrects produiront un composite viable dans le plasmide de destination.

La méthode de l'insert amplifié ne dépend pas des séquences de préfixe et suffixe, permettant une utilisation combinée avec une majorité des normes d'assemblages. Elle a également un taux de transformation plus élevé que la méthode 3A et ne nécessite pas que les plasmides aient différents gènes de résistance aux antibiotiques. Cette méthode utilise la PCR avant la digestion et avant de traiter le mélange avec l'enzyme de restriction DpnI, qui digère l'ADN méthylé comme les plasmides. En éliminant les plasmides modèles avec la DpnI, on ne laisse que l'insert à être amplifié par PCR[16].

La méthode d'assemblage dite "Gibson scarless" (sans cicatrice) permet la jonction simultanée de plusieurs bio-briques. Cette méthode nécessite que la séquence souhaitée ait un chevauchement de 20 à 150 paires de bases. Comme les briques biologiques n'ont pas ce chevauchement, la méthode nécessite des amorces de PCR pour créer des surplombs entre les briques biologiques. L'exonucléase T5 permet de créer des brins simples d'ADN dans les extrémités de certaines séquences. Une polymérase ajoute ensuite des segments d'ADN aux lacunes et une ligase Taq peut alors sceller les brins finaux[16].

• La BioBrick (sur Wikiversité)