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Microscopie trois photons

La microscopie trois photons (3PEF) ou microscopie excitée à trois photons est une microscopie à fluorescence à haute résolution basée sur un effet d'excitation non linéaire [1] - [2] - [3]. Différente de la microscopie à excitation à deux photons (2PEF), elle utilise trois photons d'excitation. Elle utilise généralement un laser de 1300 nm ou plus pour exciter les colorants fluorescents avec trois photons absorbés simultanément : ces colorants fluorescents émettent alors un photon dont l'énergie est légÚrement inférieure à trois fois celle de chaque photon incident. Par rapport à la microscopie à deux photons, la microscopie à trois photons réduit le signal hors-focus en (z la profondeur), ce qui est deux fois plus que la microscopie à deux photons[4]. De plus, la microscopie à trois photons utilise une lumiÚre proche infrarouge avec moins d'effet de diffusion tissulaire, ce qui fait que la microscopie à trois photons a une résolution plus élevée que la microscopie conventionnelle.

Concept

La fluorescence excitée à trois photons a été observée pour la premiÚre fois par Singh et Bradley en 1964 lorsqu'ils ont estimé la section efficace d'absorption à trois photons des cristaux de naphtalÚne [5]. En 1996, Stefan W. Hell a conçu des expériences pour valider la faisabilité d'appliquer une excitation à trois photons à la microscopie à fluorescence à balayage, ce qui est venu confirmer le concept de fluorescence excitée à trois photons [6].

La microscopie trois photons partage quelques similitudes avec la 2PEF. Les deux utilisent la méthode de balayage ponctuel, et sont capables d'imager un échantillon 3D en ajustant la position de la lentille de mise au point dans les directions axiale et latérale. Les structures des deux systÚmes ne nécessitent pas d'iris pour bloquer la lumiÚre floue (hors focus). Cependant, la microscopie à trois photons diffÚre de la 2PEF par sa fonction d'étalement du point (PSF), sa résolution, leur profondeur de pénétration, leur résistance à la lumiÚre floue et la force du photoblanchiment.

Dans une excitation à trois photons, le fluorophore absorbe trois photons presque simultanément. La longueur d'onde du laser d'excitation est d'environ 1200 nm ou plus en microscopie à trois photons, et la longueur d'onde d'émission est inférieure au tiers de la longueur d'onde d'excitation. La microscopie à trois photons a une pénétration plus profonde puisque la bande d'absorption optique la plus basse du tissu est de 1050 à 1100 nm, ce qui se situe dans la plage de 400 à 2400 nm. Cependant, le microscope à trois photons a besoin du laser avec une puissance plus élevée en raison de la section efficace relativement plus petite des colorants pour une excitation à trois photons, qui est de l'ordre , ce qui est beaucoup plus petit que les sections d'excitation à deux photons typiques de [7]. Les impulsions ultracourtes sont généralement d'environ 100 fs.

Resolution

Pour la microscopie Ă  balayage par fluorescence Ă  trois photons (3PEF), la fonction d'Ă©talement de l'intensitĂ© en trois dimensions (IPSF) peut ĂȘtre notĂ©e:[8],

oĂč dĂ©note l'opĂ©ration de convolution 3-D, dĂ©note la sensibilitĂ© (en intensitĂ©) d'un dĂ©tecteur de lumiĂšre incohĂ©rente, et , l'IPSF 3D pour l'objectif et le collecteur en fluorescence Ă  un seul photon, respectivement. La IPSF 3D peut ĂȘtre exprimĂ©e par:[8],

oĂč est une fonction de Bessel du 1er type d'ordre zĂ©ro. Les coordonnĂ©es axiales et radiales et sont dĂ©finies par: et

[8],

oĂč est l'ouverture numĂ©rique de l'objectif, est la pforondeur de focalisation, et la coordonnĂ©e radiale.

Couplage avec d'autres techniques multiphotoniques

Des images corrĂ©latives peuvent ĂȘtre obtenues en utilisant diffĂ©rents techniques multiphotoniques telles que la 2PEF, la 3PEF et la gĂ©nĂ©ration de troisiĂšme harmonique (THG), en parallĂšle (puisque les longueurs d'onde correspondantes sont diffĂ©rentes, elles peuvent ĂȘtre facilement sĂ©parĂ©es sur diffĂ©rents dĂ©tecteurs). Une image multicanal (composite) est ensuite construite [9].

La 3PEF est Ă©galement comparĂ©e Ă  la 2PEF: elle donne gĂ©nĂ©ralement une diminution plus faible du rapport signal / bruit (RSB) avec la profondeur, mĂȘme si le signal fluorescent Ă©mis est plus petit que la 2PEF[9].

DĂ©veloppement

AprÚs que la fluorescence excitée à trois photons eu été observée par Singh et Bradley et validée par Hell, Chris Xu a rapporté la mesure de sections efficaces d'excitation de plusieurs chromophores et indicateurs biologiques de base, ce qui a prouvé la possibilité de coupler la fluorescence excitée à trois photons à la microscopie à balayage laser [10]. En novembre 1996, David Wokosin a appliqué la fluorescence d'excitation à trois photons pour l'imagerie d'échantillons biologiques fixés, in vivo.

En 2010, la microscopie à trois photons est développée. En janvier 2013, Horton, Wang et Kobat réalisent l'imagerie in vivo d'un cerveau de souris intact en utilisant une méthode de microscope trois photons à balayage[4]. En mai 2017, Rowlands développe un microscope trois photons plein-champ (wide-field), pour bénéficier (entre autres) d'une plus grande profondeur de pénétration[11]. Enfin en octobre 2018, T Wang, D Ouzounov et C Wu ont pu imager le systÚme vasculaire et GCaMP6 calcium en utilisant un microscope à trois photons[12].

Applications

La microscopie Ă  trois photons a des domaines d'application similaires Ă  la microscopie par excitation Ă  deux photons, y compris les neurosciences[13], et l'oncologie [14]. Cependant, par rapport Ă  une excitation standard Ă  un photon ou Ă  deux photons, l'excitation Ă  trois photons prĂ©sente plusieurs avantages tels que l'utilisation de longueurs d'onde plus grandes rĂ©duisant les effets de la diffusion de la lumiĂšre et augmentant la profondeur de pĂ©nĂ©tration du faisceau d'excitation de l'Ă©chantillon[15]. La nature non linĂ©aire de la microscopie Ă  trois photons confine l'excitation Ă  un volume plus petit, rĂ©duisant le signal hors-focus et minimisant le photoblanchiment sur l'Ă©chantillon biologique[15]. Ces avantages de la microscopie Ă  trois photons lui permettent de visualiser la morphologie et la physiologie tissulaires in vivo et ex vivo au niveau cellulaire au plus profond des tissus diffusants [4], et permet une imagerie volumĂ©trique rapide [16]. Dans une Ă©tude rĂ©cente, Xu a dĂ©montrĂ© le potentiel de l'imagerie Ă  trois photons pour des Ă©tudes non invasives de systĂšmes biologiques vivants[12]. Il utilise une microscopie Ă  fluorescence Ă  trois photons excitĂ©e Ă  1320 nm pour imager la structure et le fonctionnement du cerveau de la souris Ă  travers le crĂąne, avec une rĂ©solution spatiale et temporelle Ă©levĂ©es (la FWHM latĂ©rale et axiale Ă©taient de 0,96 ÎŒm et 4,6 ÎŒm respectivement), ainsi que de grands champs de vue (FOV, centaines de ”m), Ă  une profondeur assez importante (> 500 ÎŒm). Ce travail dĂ©montre l'avantage d'une excitation non-linĂ©aire d'ordre supĂ©rieur pour l'imagerie Ă  travers une couche hautement diffusante, qui s'ajoute aux avantages prĂ©cĂ©demment signalĂ©s de la 3PEF pour l'imagerie profonde d'Ă©chantillons densĂ©ment marquĂ©s.

Voir Ă©galement

Notes et références

  1. Nicholas G. Horton, Ke Wang, Demirhan Kobat, Catharine G. Clark, Frank W. Wise, Chris B. Schaffer et Chris Xu, « In vivo three-photon microscopy of subcortical structures within an intact mouse brain », Nature Photonics, vol. 7, no 3,‎ , p. 205–209 (PMID 24353743, PMCID 3864872, DOI 10.1038/nphoton.2012.336, Bibcode 2013NaPho...7..205H)
  2. (en) Bingying Chen, Xiaoshuai Huang, Dongzhou Gou, Jianzhi Zeng, Guoqing Chen, Meijun Pang, Yanhui Hu, Zhe Zhao et Yunfeng Zhang, « Rapid volumetric imaging with Bessel-Beam three-photon microscopy », Biomedical Optics Express, vol. 9, no 4,‎ , p. 1992–2000 (PMID 29675334, PMCID 5905939, DOI 10.1364/BOE.9.001992)
  3. (en) Rebecca M. Williams, Jason B. Shear, Warren R. Zipfel, Sudipta Maiti et Watt W. Webb, « Mucosal Mast Cell Secretion Processes Imaged Using Three-Photon Microscopy of 5-Hydroxytryptamine Autofluorescence », Biophysical Journal, vol. 76, no 4,‎ , p. 1835–1846 (PMID 10096882, PMCID 1300160, DOI 10.1016/S0006-3495(99)77343-1, Bibcode 1999BpJ....76.1835W)
  4. Nicholas Horton, Ke Wang, Demirhan Kobat, Catharine Clark, Frank Wise, Chris Schaffer et Chris Xu, « In vivo three-photon microscopy of subcortical structures within an intact mouse brain », Nature Photonics, vol. 7, no 3,‎ , p. 205–209 (PMID 24353743, PMCID 3864872, DOI 10.1038/nphoton.2012.336, Bibcode 2013NaPho...7..205H)
  5. S. Singh et L. T. Bradley, « Three-Photon Absorption in Napthalene Crystals by Laser Excitation », Physical Review Letters, vol. 12, no 22,‎ , p. 612–614 (DOI 10.1103/PhysRevLett.12.612, Bibcode 1964PhRvL..12..612S)
  6. S W Hell, K Bahlmann, M Schrader, A Soini, H M Malak, I Gryczynski et J R Lakowicz, « Three-photon excitation in fluorescence microscopy », Journal of Biomedical Optics, vol. 1, no 1,‎ , p. 71–74 (PMID 23014645, DOI 10.1117/12.229062, Bibcode 1996JBO.....1...71H)
  7. Keisuke Toda, Keisuke Isobe, Kana Namiki, Hiroyuki Kawano, Atsushi Miyawaki et Katsumi Midorikawa, « Temporal focusing microscopy using three-photon excitation fluorescence with a 92-fs Yb-fiber chirped pulse amplifier », Biomedical Optics Express, vol. 8, no 6,‎ , p. 2796–2806 (PMID 28663907, PMCID 5480430, DOI 10.1364/BOE.8.002796)
  8. Min Gu, « Resolution in three-photon fluorescence scanning microscopy », Optics Letters, vol. 21, no 13,‎ , p. 988–990 (PMID 19876227, DOI 10.1364/OL.21.000988, Bibcode 1996OptL...21..988G)
  9. Khmaies Guesmi, Lamiae Abdeladim, Samuel Tozer, Pierre Mahou, Takuma Kumamoto, Karolis Jurkus, Philippe Rigaud, Karine Loulier, Nicolas Dray, Patrick Georges, Marc Hanna, Jean Livet, Willy Supatto, Emmanuel Beaurepaire et FrĂ©dĂ©ric Druon, « Dual-color deep-tissue three-photon microscopy with a multiband infrared laser », Light: Science & Applications, vol. 7, no 1,‎ (ISSN 2047-7538, DOI 10.1038/s41377-018-0012-2)AccĂšs libre
  10. C Xu, W Zipfel, J B Shear, R M Williams et W W Webb, « Multiphoton fluorescence excitation: new spectral windows for biological nonlinear microscopy. », Proc Natl Acad Sci U S A, vol. 93, no 20,‎ , p. 10763–10768 (PMID 8855254, PMCID 38229, DOI 10.1073/pnas.93.20.10763, Bibcode 1996PNAS...9310763X)
  11. Christopher Rowlands, Demian Park, Oliver Bruns, Kiryl Piatkevich, Dai Fukumura, Rakesh Jain, Moungi Bawendi, Edward Boyden et Peter So, « Wide-field three-photon excitation in biological samples », Light: Science and Applications, vol. 6, no 5,‎ , e16255 (PMID 29152380, PMCID 5687557, DOI 10.1038/lsa.2016.255, Bibcode 2017LSA.....6E6255R)
  12. Tianyu Wang, Dimitre Ouzounov, Chunyan Wu, Nicholas Horton, Bin Zhang, Cheng-Hsun Wu, Yanping Zhang, Mark Schnitzer et Chris Xu, « Three-photon imaging of mouse brain structure and function through the intact skull », Nature Methods, vol. 15, no 10,‎ , p. 789–792 (PMID 30202059, PMCID 6188644, DOI 10.1038/s41592-018-0115-y)
  13. Jason Kerr et Winfried Denk, « Imaging in vivo: watching the brain in action », Nature Reviews Neuroscience, vol. 9, no 3,‎ , p. 195–205 (PMID 18270513, DOI 10.1038/nrn2338)
  14. Rebecca M. Williams, Andrea Flesken-Nikitin, Lora Hedrick Ellenson, Denise C. Connolly, Thomas C. Hamilton, Alexander Yu. Nikitin et Warren R. Zipfel, « Strategies for High Resolution Imaging of Epithelial Ovarian Cancer by Laparoscopic Nonlinear Microscopy », Translational Oncology, vol. 3, no 3,‎ , p. 181–194 (PMID 20563260, PMCID 2887648, DOI 10.1593/tlo.09310)
  15. AdriĂ  Escobet-MontalbĂĄn, Federico M. Gasparoli, Jonathan Nylk, Pengfei Liu, Zhengyi Yang et Kishan Dholakia, « Three-photon light-sheet fluorescence microscopy », Optics Letters, vol. 43, no 21,‎ , p. 5484–5487 (PMID 30383037, DOI 10.1364/ol.43.005484, Bibcode 2018OptL...43.5484E, hdl 10023/18816)
  16. Bingying Chen, Xiaoshuai Huang, Dongzhou Gou, Jianzhi Zeng, Guoqing Chen, Meijun Pang, Yanhui Hu, Zhe Zhao, Yunfeng Zhang, Zhuan Zhou, Haitao Wu, Heping Cheng, Zhigang Zhang, Chris Xu, Yulong Li, Liangyi Chen et Aimin Wang, « Rapid volumetric imaging with Bessel-Beam three-photon microscopy », Biomedical Optics Express, vol. 9, no 4,‎ , p. 1992–2000 (PMID 29675334, PMCID 5905939, DOI 10.1364/boe.9.001992)
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